circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学
技术领域：
，尤其涉及一种制备活动性肺结核病特异性circrnas的方法。
背景技术：
：结核病是一个重大的全球性公共卫生问题，严重威胁着人类健康。肺结核是结核病中最常见的临床类型。肺结核是一种由结核杆菌感染引起的慢性传染病。根据世界卫生组织（who）报道，2015年，全世界新发结核病数量约为1040万例，新发48万例耐多药结核病，有140万人死于结核病。中国发病人数居世界第二位。据估计，近5.5亿的结核感染人群，每年新发生肺结核患者100万例。死亡率2.32/10万。由于肺结核病主要通过空气传播，具有高发病率和高死亡率，因此对社会产生了相当大的负担。早发现、早诊断、早治疗，可控制肺结核病传播，是遏制肺结核病流行的最重要措施；但是活动性肺结核病的研究难点是缺乏特异的标志物。环状rna（circularrnas，circrnas）是一类新型非编码rna，不具有5'末端帽子和3'末端poly(a)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码rna分子，与传统非编码不同，环状rna分子为封闭环状结构，由于对核酸酶不敏感，因此比线性rna更为稳定。circrnas有组织特异性与时空特异性，不同组织之间的circrnas表达量不同，同一组织或器官在不同生长阶段，其中的circrnas表达量也会变化，circrnas可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多种层面实现对基因表达的调控，其作用机制非常复杂，至今尚未完全清楚，比如已有许多研究证实了mirnas参与调节tgfβ表达量和emt过程，但参与此过程的circrnas并不清楚。另外，一些在线网站比如starbase2.0网站预测准确率低，比如现在已经比较明确的gas5和mirna21都预测不到，而且人血清中存在多达1000个circrnas，还有一定的变化，导致circrnas无法有效利用，同时circrnas的检测和分析已成为其应用的关键问题，现有测序法操作复杂，费用贵，测序深度有限，效率较低，导致circrnas的检测变数较大；目前已有一些关于circrnas作为癌症分子标志物的研究，但是仅是存在可能性，比如科学家发现结直肠癌患者大部分新的circrnas表达上调，在胃癌中有的circrnas表达下调；有研究者在emt中发现，上百种circrna的表达受tgf-β的影响，比如，dock1是一种鸟苷酸交换因子（gef），可激活rac以提高细胞活性，使用tgf-β诱导emt过程后，上皮细胞中含量最为丰富的dock1circrna水平下降了30倍，而dock1mrna水平则上升了2倍，提示这一circrna的功能之一可能是引起上皮细胞中mrna的下调，然而，鉴于上皮细胞中含有大量的dock1circrna，其很可能还有其他方面的功能，总而言之，circrna在emt中的确切作用及相关机制仍有待进一步明确。虽然circrna具有保守性和稳定性，但目前检测和定性circrna的方法仍有局限性，不同的生物信息学方法或测序数据造成circrna的识别出现偏倚；因此针对活动性肺结核病，研发合适的特异性circrnas作为标志物在调控基因转录、作为疾病诊断标志物等方面具有重要的研究和临床意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种作为针对活动性肺结核病特异性标志物的circrnas及其应用。本发明首次公开了两个circrnas作为活动性肺结核病特异性标志物，表达谱的变化具有组织和细胞特异性，同时具有很高的稳定性；利用临床上比较容易直接获得的全血标本，结合设计的引物对进行rt-qpcr验证circrnas的差异表达，具有快速、简单、省时、检测灵敏度高，样品消耗少的优点，是非常适合的利用差异表达的circrnas诊断活动性肺结核病的方法。本发明的技术方案如下：circrnas作为活动性肺结核病特异性标志物的应用；所述circrnas为circrna-00074或者circrna-14623。circrnas在制备活动性肺结核病特异性标志物中的应用；所述circrnas为circrna-00074或者circrna-14623。circrnas在制备活动性肺结核病特异性诊断试剂中的应用；所述circrnas为circrna-00074或者circrna-14623。本发明中，通过检测人体全血样本中的circrna-00074或者circrna-14623的表达情况即可诊断活动性肺结核病，与现有临床检测手段结果吻合。本发明公开了活动性肺结核病诊断试剂盒，该试剂盒含有能够对circrnas的表达量进行定量的试剂，所述circrnas为circrna-00074或者circrna-14623；优选的，所述能够对circrnas的表达量进行定量的试剂包括rt-qpcr引物对；所述rt-qpcr引物对的序列为seqidno：1、seqidno：2或者seqidno：3、seqidno：4。本发明还公开了活动性肺结核病诊断试剂盒在制备活动性肺结核病诊断试剂中的应用，该试剂盒含有能够对circrnas的表达量进行定量的试剂，所述circrnas为circrna-00074或者circrna-14623；优选的，所述能够对circrnas的表达量进行定量的试剂包括rt-qpcr引物对；所述rt-qpcr引物对的序列为seqidno：1、seqidno：2或者seqidno：3、seqidno：4。本发明公开了能够对circrnas的表达量进行定量的试剂在制备活动性肺结核病诊断试剂盒中的应用或者能够对circrnas的表达量进行定量的试剂在制备活动性肺结核病诊断试剂中的应用，所述circrnas为circrna-00074或者circrna-14623；优选的，所述能够对circrnas的表达量进行定量的试剂包括rt-qpcr引物对；所述rt-qpcr引物对的序列为seqidno：1、seqidno：2或者seqidno：3、seqidno：4。本发明通过提取活动性肺结核病患者和健康对照者全血样本的总rna，设计rt-qpcr特异性引物，并rt-qpcr验证活动性肺结核病特异性circrnas的表达情况，发现在活动性肺结核病人和正常健康人中检测circrna-00074和circrna-14623的表达量，结果显示在肺结核病人中两个circrnas都发生了显著性的上调表达；由此说明，通过检测circrna-00074或者circrna-14623的表达水平，可以有效区分活动性肺结核病人和正常健康人。本发明中，circrna-00074序列为seqidno：5，具体如下：gtgggagatgagggagcaggccacttcgtgaagatggtgcacaacgggatagagtatggggacatgcagctgatctgtgaggcataccacctgatgaaagacgtgctgggcatggcgcaggacgagatggcccaggcctttgaggattggaataagacagagctagactcattcctgattgaaatcacagccaatattctcaagttccaagacaccgatggcaaacacctgctgccaaagatcagggacagcgcggggcagaagggcacagggaagtggaccgccatctccgccctggaatacggcgtacccgtcaccctcattg所述circrna-14623序列为seqidno：6，具体如下：aaaaagaagacacgactgataacatctgagaggaaggaaactgcattgtgctggggatctgcatgtcacattataaaaagcaatttttttttttaatagaaccagcctttcaaacagtttccagagatggattatcctactttacttttggctcttcttcatgtatacagagctctatgtgaagaggtgctttggcatacatcagttccctttgccgagaacatgtctctagaatgtgtgtatccatcaatgggcatcttaacacaggtggagtggttcaagatcgggacccagcaggattccatagccattttcagccctactcatggcatggtcataaggaagccctatgctgagagggtttactttttgaattcaacgatggcttccaataacatgactcttttctttcggaatgcctctgaagatgatgttggctactattcctgctctctttacacttacccacagggaacttggcagaaggtgatacaggtggttcagtcaggtaagggcaagttttttttttttttaaatccctttttatccacttacaacatttatttctataaagcccaagtagaagctatagaatgtcttctcgtatttctgtggcattctccaattccatttctagatgctttgatgttactgctttgaaggagcaatcttgggagtctgtttcatttttctgactgtgctgttgtgtccgagtagaagtgcctttcaaatttgaatgtagtagaagaaagcacaggttttttgttgtcttaatgataacctgagccttgattaaactgatgttggcaacacatgggttcaggatcctttcagggttttatcacagtgacatagcaccattcccttctgctggacactccagcacccacatcaacccctgtgtgttcaaggttcttcctacagtaccaaatctaagtttgttttctttctttctttttctctttctttctttctctctctctctttctttcttttctttcctttctttcctgtctttctttcttcttccttcttttttttttttttttttttttttttttgatggagtcttgctctgtcaccaggctggagtacagtagcatgatcttggctcactgcaacctccagctcctgggctcaagcgattctcctacctcagccccgcaagtagctgggactacaggtgtgcaccgccacgtgatatggtttgaattcccatgtgttgtgggagggacctggtgggaggtaattgaatcgtgcgggcaagtctttcccatgctgtcctcatgatagtgcataagtctcatgagatctgatggtttaaaaaagaggagttcccctgcactagctctctctgtttgcctgctgccatccatgtaagacgtgacttctccttgccttccaccttgattgtgaggcttccccagacatgtggtgctgtaagtccaattaaacctctttcttttgtaaattgcccagtcttgggaatatcttcatcagcagggtgaaaacggactaatacaccatgccaggctgattgttgtattttttgtagagatgaggtttcaacatgttgcccaggctggtcttggactcctgagttcaagtgatccaactgcctcggcctcccagagtgccaggattactggcatgaaccaccaagcttggccctggctctatctttcacctcatccaggtttagctagagaggacactttcttcataaattgtgagctgtggtgtcagaaagaacccaatgatcccttggagtgttttttgctttatctaccagagattgtggttttgtctttctagtgatgactacatgaactggttgtagtatattggaaacacttgggtttatagtcatcactttccatcaacctggtgttagttgctcgatccctctgaatctcaggttcctgaagaggaaatggggttggtagtg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atgctgctaataaagacatacctgagacagggtaatttataaaggaaagaggtttaattgattctcagttcagtatgggtggggaggcctcaggaaacttacaatcatggtggaaggggaagcaaatatgtccttcacatggtagcagggagaagaagagtgagtgcccagagcaggggaagccccttataaaaccatcagatctcatgagaactaactcactatcatgagaacaggatgggggaaaccacccccatgattcagttatctccacctggtctctcccacgacacgtgagggttatgggaactacaactcaagatgagatttgggtgggcacacggccaaattatatcatatgatcatggagactgataagcccaaatttgcagtgtgggcttgcaggctgcagacccaggagagccgatggtacaggtgaagcccaggtcatctgctgcagaatccctcttgcttggggaggctggtctttttgttgaattaggctcacctacattatggaggcaaactgcttattcaaaattcaccaatttaaatgttaatctcatcccaaaacacccttcaaattgacacgtaaaattaaccatcatacctgttttggaaaatgatatggcattagctagttaaaaaccccaaatcctatgatccaataattctactctgtttggtatccaagagttctctcattatagggaaaattcctgacaatatttatagcaacagtgattgcaatagcaaaaaattggtaacaacccaaatacccatcaacagtagaaccgaaaagcacactgaggtctattcacacattaggatactctacatcactaaaatgagtgaattatcacttgctcaccgacatggatgaagctcatgaactttgtgttgaaagaaaagagcaagttaccaaaaaaaataggtaaactagggttccttttctttaaaggttttagaaatatgcataattaaacaatacgttatttatagatacaaacgtggtaaaactataaagaaaagcaaagttcagaaacatggtaggtgggggatagaatagaatcaggaagggctgaaagggtctttaaggctcatagtcagggtgttttccttatacaggtgttttattttgcatttgtctcaaaatgttttagaagatttctttcaaatctactgatttctttttcttttccttttttgagacagagtctcactctgttgcccaggctggagtgcagtggcatgatctcagctcattgcaacctctgcctcctgggttcaagtggttctcctgcctcagcctcctgagtagctgggattacaggcctgcatcatcacacccagctaatttttgtatttttgtagagatgggggttttgccatgttggccaggctgatctcaaactcctgacctcaggtgatccaccccaccttggcctcccaaagtgctggaattacaggcataggccaccttgcctggccaaatctactgatttctaatggtgaaaagagatgtgattgcaatttttgagcagttgaaagctctaaggtaaggatgaaatcttcattctgatatggcctgggggccaggtagaggtaagtttcagcaatggtttcaaatttttatgatccaaggactaaaaaatgatgattttagtgaaaaagatgtgaaattaagagaccaacttggctagcaagagtggaattaagtctgtttcaggtgtattaaattgtaaagtagcctttgaccagctgacaattgaaattatggaacaacaaaccaggattgaaaatatccaatttgaagtcatctgaatgatcatccagcacatgtggatggatggggttaactaagaaagtaccaatggatgggggcagaagtctaaggtcatagcttgtggcttggaggatggtcacattgtagtgtgttaaagaaggtgttcatgttaaagaatgtagagggcatagagaaaagagggggagagttgggagggagaggaaagtgaacaggtgaattattgatgtgagagcagaagacacatagaactcatatttatagtagagggttagattttcttgctccacacatgcaggtactttgtgttggctgtattgtatgtttgctgactctgtgatctcccatattccagtccatttatctcaaactgggcacagagatgttcctcactgtttccctttaagagtctcattctctcccaggtgggatgaggctccttatatgccatccatgctcattcttagaaggctcttatctctacacccttcagggacaagtgttctctgtccaggttcccagcagctgacatagcagccaaagttttctttcattcttgtatatatctgctggttagtggcactaaagagattcctttaatattaagggctccagaattgatggcagttctgaggaatcctatgatgaaagggattctaaagatcatgctggcctatatattagttgagggcagcatggccaacatttttctaatgctggggtataatctcagcctttaaatttgatttaaagctggggagagggaagtgtctcaaatctggcttttataaatgggtgtgctgatttgcaggagctgaacccacttatccattaattcactcatcaagtctttcctgagaatctacaatgtacaatgtaatgttcagtggtttggaagatagaaagacatagatcttagctctaaataggatgtagaatattgggagagagaaaagtttatatcacaaattattatttgaggcaaaaaaataagtcgcattgtagtctagaggatataattttattttacctaggaaattcagggcagagtccctgaaaaagtggaatttgaactgccaacccagaaaatttggatgttgagattaataggcactattccaggagaattgctttagaaaattatctagaaaatagacagctattttctagatagtaggctccagtgtaacctactttggaagataattttcattgttcaaaaggaccccaacaacaaaacaccaaaaacctctaaaattgaaccaacacatagaattgatcaacaaattaaagcaatttattccggtttacaattcatggcttggttgacatgttgaattgctgcttcaaaaggcaagggaagccagatgcactatgcaattgtattttacaacctatcttacggtatttgcacactttcatttcggcttttgttttgcctatcccaaattcagaaggaaggaagaaaacatacgaaaatgacactatcatatctattaatgacaggtgaaagtgatggaggaggagatttggtctgaaaggctattgcctgtcaaaggaaatttcaaacaaggttaagaaggccacagagaaagagtctttcttattctcctgttataagggtcaccaattcctgctagcttccttagtccttgtgtagacctttttcagttttgtctatcatatgtatctctatcacttttaattttcttaagtcagatggagaaataagaaaaaaagtcattccaagtcaactgattagagaatgaagccataagctctctcttcaggcccattctggtgagattagaaataagtcataaaggttttatatatccatgtgtgtgtgtatgcatgcacacacacaagactaaaaaatgttacattttagcagtttttcatttaaagaaaaaaatactaaatggtacctataaggaatccacaagggatgaagcagaaacattttaaaggcttaaaaatctcactccgtaatgaaataaaatagtatataaagaaggcagacgataaaaaacattttaagactcacagaaagcaaggttatggtcactgcacttctcaagggtgaagtaaatgggaaactgaaagtggatggttaccagaacgtgtgccaaggttgtttttatccacgtgctttccctgtgctaagcccaggaaggaacaggcacaagaacacatgtcactgtgggaatcaaccctcaggctttcaggcaaagctctgtaatcaaaaatcaaaaaaaaagagaaagtttaaaaactctctaaagccagataatactaaatttatatacacaattgaattcaataatcgaatggctgatacagtggaattcacgtacaggcacgggtacaggcttggatttttggggattgagattgtccgtctgtctcgatgcctgggtttctctctacctccttcacctcctttatgccccgtgagacaccccagtctttgacacttctgagctgtagcaaaatccagaggaaacttttactttgggcttgttgtcaaatgcagtcaggcgagccagagcagggagtggaattggctgccatctttgtgtgcagccattttgtttatttatactacctatgtaaacttgaaactgtacccttcttattgtaggtatttatattttcaagatgattgtagagtaggggtatgcttggctgaattgatagagaatgggctacagctgaagcttcggacactgattctcctgtgacctcagaacattct本发明中，circrnas相对表达量分析采用graphpadprism5软件，采用软件中单样本t检验和独立样本t检验，p<0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，p<0.01时，结果在统计学上具有极显著性差异。研究发现，相对健康人样本，活动性肺结核病人circrna-00074和circrna-14623的表达量都发生了显著性的上调表达，在统计学上具有极显著性差异，可以说明circrna-00074或者circrna-14623可以作为活动性肺结核病特异性标志物用于诊断。附图说明图1为circrna-00074在肺结核病人和正常健康人之间的差异表达图；图2为circrna-14623在肺结核病人和正常健康人之间的差异表达图。具体实施方式总rna提取试剂盒购自ambion公司；rt-qpcr反转录试剂盒购自fermentas公司；sybrsystemmix购自takara宝生物工程（大连）有限公司；96孔板及膜购自axygen公司。实施例一活动性肺结核病人circrna-00074和circrna-14623的表达量都发生了显著性的上调表达a1：收集20例临床确诊的活动性肺结核患者和20例健康对照者。所有参加者血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空edta抗凝采血管，采集外周血3.0ml，颠倒混匀；加入3倍体积红细胞裂解液（300μl血液加入900μl红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放10min，期间颠倒几次；3000rpm离心10min，弃上清。用1ml的红细胞裂解液，轻轻悬浮；3000rpm离心5min，弃上清；用1ml的trizolreagent，轻轻悬浮，-80℃冰箱保存。a2：将活动性肺结核病患者和健康对照者含有白细胞的trizolreagent样本于-80℃中取出，待4℃自然溶解；加入等体积酚氯仿，最大转速室温离心10min。取上清；加1.25倍体积100%乙醇；将混合液加入柱子中，室温，13000rpm，1min，弃流过液；加350μlmirnawashsolution1(mirvana™mirnaisolationkit，ambion-1561)到离心柱中，13000rpm，1min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；混合10μldnasei和70μlbufferrddqiagen(#79254)总体积：80μl，加到离心柱中的膜上，室温放置10min；加350μlmirnawashsolution1到离心柱中，13000rpm，1min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；500μlwashsolution2/3过柱两次，13000rpm，1min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；空柱离心1min，将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加100μl95℃预热的elutionsolution，放置3min，室温最高转速离心30s，收集管中的液体即为提取的总rna，可放置在-70℃保存。取活动性肺结核病患者和健康对照者总rna样本1.0μl，经安捷伦生物分析仪器nanodrop-2000检测od值，在紫外分光光度计上测定a260/a280数值，测定结果总rna浓度在5～10ng/μl之间，a260/a280数值在1.2～1.9之间，表示总rna的纯度较好，无蛋白或者时其他有机物的污染亦无总rna降解。a3：设计circrnasrt-qpcr引物对rt-qpcr引物长度21bp左右，退火温度tm值在60℃左右，gc含量约40%-60%；引物对的序列为seqidno：1、seqidno：2或者seqidno：3、seqidno：4，参见表1。以内参β-actin在活动性肺结核病患者全血样本中扩增为例，观察扩增情况，扩增曲线平滑且随着循环数的增加，荧光信号具有明显的对数期，而空白对照无连续曲线生成，说明扩增情况良好。对扩增的circrnas产物做溶解曲线，有且只有一个明显的单峰，而无模板对照无明显波峰出现，说明经扩增后产物是特异的circrnas，即此定量无污染，准确，可靠。表1rt-qpcr引物primerssequence(5'to3')ntcircrna-00074-上游atactctatcccgttgtgcac21seqidno：1circrna-00074-下游agaagggcacagggaagtg19seqidno：2circrna-14623-上游caatgcagtttccttcctctc21seqidno：3circrna-14623-下游ggctgaattgatagagaatgg21seqidno：4β-actin-上游tcatgaagtgtgacgttgacatccgt26β-actin-下游cctagaagcatttgcggtgcacgatg26a4：活动性肺结核病诊断试剂盒rt-qpcr活动性肺结核病相关的特异性circrnas用fermentas反转录试剂盒进行反转录，反转录反应体系：总rna2.5μl，rnase抑制剂rri0.25μl，dntp（10mmeach）0.5μl，5×m-mulvbuffer1.0μl，随机引物（2µm）0.5μl，m-mulv反转录酶0.25μl，总体积5μl。分两步方法进行，第一步：65℃，5min；冰上，15min；第二步：42℃，60min；70℃，10min；反应完毕后，保存于-80℃冰箱。rt-qpcr体系：ddh2o7μl，sybrsystemmix10μl，50*roxrefenencedye0.4μl，上游引物（10µm）/下游引物（10µm）0.8μl，模板cdna1μl，总体积20μl；混匀后稍离心，在cfx96荧光定量pcr仪中进行荧光定量pcr反应，反应参数设置为：95℃60s，然后95℃5s，60℃30s，共40个循环。circrnas荧光定量数据分析以β-actin为内参基因，对目标基因进行归一化处理，已确保相等数量的样品中比较目标基因的量。circrnas表达倍数的变化公式为rq=2-△△ct，其中△△ct=（ctlncrna-ctβ-actin）oc-（ctlncrna-ctβ-actin）meanon。rq代表相对表达变化量，ctlncrna和ctβ-actin分别代表同个样本中目标lncrna和内参基因β-actin的ct值，oc代表活动性肺结核病患者，on代表健康对照者，meanon代表所有正常对照组中的平均值。实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照为反应体系中不加cdna模板，以ddh2o代替，所有荧光定量pcr均做3次重复。circrnas相对表达量分析采用graphpadprism5软件，采用软件中单样本t检验和独立样本t检验。p<0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，p<0.01时，结果在统计学上具有极显著性差异，差异表达的circrnas数据处理结果以平均值±标准误表示，绘制含误差线的散点图。分别在20例肺结核病人和20例正常健康人中检测circrna-00074和circrna-14623的表达量，结果显示在肺结核病人中两个circrnas都发生了显著性的上调表达，circrna-00074和circrna-14623的表达量差异分别见附图1、附图2，表达差异在2倍以上；p<0.01。实施例二验证circrna-00074和circrna-14623的表达上调特异性a1：收集20例临床确诊的肺炎非肺结核患者和20例临床确诊的肺癌非肺结核患者。所有参加者血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空edta抗凝采血管，采集外周血3.0ml，颠倒混匀；加入3倍体积红细胞裂解液（300μl血液加入900μl红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放10min，期间颠倒几次；3000rpm离心10min，弃上清。用1ml的红细胞裂解液，轻轻悬浮；3000rpm离心5min，弃上清；用1ml的trizolreagent，轻轻悬浮，-80℃冰箱保存。a2：将患者含有白细胞的trizolreagent样本于-80℃中取出，待4℃自然溶解；加入等体积酚氯仿，最大转速室温离心10min。取上清；加1.25倍体积100%乙醇；将混合液加入柱子中，室温，13000rpm，1min，弃流过液；加350μlmirnawashsolution1(mirvana™mirnaisolationkit，ambion-1561)到离心柱中，13000rpm，1min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；混合10μldnasei和70μlbufferrddqiagen(#79254)总体积：80μl，加到离心柱中的膜上，室温放置10min；加350μlmirnawashsolution1到离心柱中，13000rpm，1min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；500μlwashsolution2/3过柱两次，13000rpm，1min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；空柱离心1min，将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加100μl95℃预热的elutionsolution，放置3min，室温最高转速离心30s，收集管中的液体即为提取的总rna，可放置在-70℃保存。取患者总rna样本1.0μl，经安捷伦生物分析仪器nanodrop-2000检测od值，在紫外分光光度计上测定a260/a280数值，测定结果总rna浓度在5～10ng/μl之间，a260/a280数值在1.2～1.9之间，表示总rna的纯度较好，无蛋白或者时其他有机物的污染亦无总rna降解。a3：设计circrnasrt-qpcr引物对如实施例一。a4：用fermentas反转录试剂盒进行反转录，反转录反应体系：总rna2.5μl，rnase抑制剂rri0.25μl，dntp（10mmeach）0.5μl，5×m-mulvbuffer1.0μl，随机引物（2µm）0.5μl，m-mulv反转录酶0.25μl，总体积5μl。分两步方法进行，第一步：65℃，5min；冰上，15min；第二步：42℃，60min；70℃，10min；反应完毕后，保存于-80℃冰箱。rt-qpcr体系：ddh2o7μl，sybrsystemmix10μl，50*roxrefenencedye0.4μl，上游引物（10µm）/下游引物（10µm）0.8μl，模板cdna1μl，总体积20μl；混匀后稍离心，在cfx96荧光定量pcr仪中进行荧光定量pcr反应，反应参数设置为：95℃60s，然后95℃5s，60℃30s，共40个循环。分别在肺炎病人和肺癌病人中检测circrna-00074和circrna-14623的表达量，结果显示在肺炎病人和肺癌病人中两个都没有发生上调表达，与健康人相比。本发明公开的活动性肺结核病特异性circrnas，利用设计的引物对进行rt-qpcr方法验证得到差异表达量，获得活动性肺结核病特异性circrnas标志物，对研究控制肺结核病传播，降低肺结核病的发生率具有重要的意义。序列表<110>苏州大学附属第一医院<120>circrnas作为活动性肺结核病特异性标志物的应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>1atactctatcccgttgtgcac21<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>2agaagggcacagggaagtg19<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>3caatgcagtttccttcctctc21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>4ggctgaattgatagagaatgg21<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>5tcatgaagtgtgacgttgacatccgt26<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>6cctagaagcatttgcggtgcacgatg26<210>7<211>325<212>dna/rna<213>人工序列(artificial)<400>7gtgggagatgagggagcaggccacttcgtgaagatggtgcacaacgggatagagtatggg60gacatgcagctgatctgtgaggcataccacctgatgaaagacgtgctgggcatggcgcag120gacgagatggcccaggcctttgaggattggaataagacagagctagactcattcctgatt180gaaatcacagccaatattctcaagttccaagacaccgatggcaaacacctgctgccaaag240atcagggacagcgcggggcagaagggcacagggaagtggaccgccatctccgccctggaa300tacggcgtacccgtcaccctcattg325<210>8<211>11510<212>dna/rna<213>人工序列(artificial)<400>8aaaaagaagacacgactgataacatctgagaggaaggaaactgcattgtgctggggatct60gcatgtcacattataaaaagcaatttttttttttaatagaaccagcctttcaaacagttt120ccagagatggattatcctactttacttttggctcttcttcatgtatacagagctctatgt180gaagaggtgctttggcatacatcagttccctttgccgagaacatgtctctagaatgtgtg240tatccatcaatgggcatcttaacacaggtggagtggttcaagatcgggacccagcaggat300tccatagccattttcagccctactcatggcatggtcataaggaagccctatgctgagagg360gtttactttttgaattcaacgatggcttccaataacatgactcttttctttcggaatgcc420tctgaagatgatgttggctactattcctgctctctttacacttacccacagggaacttgg480cagaaggtgatacaggtggttcagtcaggtaagggcaagttttttttttttttaaatccc540tttttatccacttacaacatttatttctataaagcccaagtagaagctatagaatgtctt600ctcgtatttctgtggcattctccaattccatttctagatgctttgatgttactgctttga660aggagcaatcttgggagtctgtttcatttttctgactgtgctgttgtgtccgagtagaag720tgcctttcaaatttgaatgtagtagaagaaagcacaggttttttgttgtcttaatgataa780cctgagccttgattaaactgatgttggcaacacatgggttcaggatcctttcagggtttt840atcacagtgacatagcaccattcccttctgctggacactccagcacccacatcaacccct900gtgtgttcaaggttcttcctacagtaccaaatctaagtttgttttctttctttctttttc960tctttctttctttctctctctctctttctttcttttctttcctttctttcctgtctttct1020ttcttcttccttcttttttttttttttttttttttttttttgatggagtcttgctctgtc1080accaggctggagtacagtagcatgatcttggctcactgcaacctccagctcctgggctca1140agcgattctcctacctcagccccgcaagtagctgggactacaggtgtgcaccgccacgtg1200atatggtttgaattcccatgtgttgtgggagggacctggtgggaggtaattgaatcgtgc1260gggcaagtctttcccatgctgtcctcatgatagtgcataagtctcatgagatctgatggt1320ttaaaaaagaggagttcccctgcactagctctctctgtttgcctgctgccatccatgtaa1380gacgtgacttctccttgccttccaccttgattgtgaggcttccccagacatgtggtgctg1440taagtccaattaaacctctttcttttgtaaattgcccagtcttgggaatatcttcatcag1500cagggtgaaaacggactaatacaccatgccaggctgattgttgtattttttgtagagatg1560aggtttcaacatgttgcccaggctggtcttggactcctgagttcaagtgatccaactgcc1620tcggcctcccagagtgccaggattactggcatgaaccaccaagcttggccctggctctat1680ctttcacctcatccaggtttagctagagaggacactttcttcataaattgtgagctgtgg1740tgtcagaaagaacccaatgatcccttggagtgttttttgctttatctaccagagattgtg1800gttttgtctttctagtgatgactacatgaactggttgtagtatattggaaacacttgggt1860ttatagtcatcactttccatcaacctggtgttagttgctcgatccctctgaatctcaggt1920tcctgaagaggaaatggggttggtagtgccattctacttgttgaatggctgagggacgat1980atatttaaagaacttggtccatggtagtcagagaatgatacatcttattatttcctatgc2040ttgtgatccaaaaggactaataatgaaattttcagatattagtgacaatctaaagcaggg2100aatatttttggaactgtgtgtttcttgtgtggtgtctctcaaattatactcatggctgta2160cagagaagaacattttatgacatctgacataatagtgctttatttttaagggatctgtgc2220tctaaaagaacaagtacagaattatatgaggaatatcaaatggtcaggagataagaaaca2280tcttcatatatttagttttccctttctctttaggtgtagctagggtgaagactaattttg2340tgtatatagctgaggcttatagagtgtcaatttacaatgtttctttagttaaatgtttat2400ttattaaagactctgtttcaccatacaagtcctcatttgctgttgtatgtagacacctgt2460taaatcctgcttggaagtttttactgtgtagtttgctataaatcagtcaggcaggcgaag2520tagaagattggcaaagcttttaacatagactgagccattggaaacaaggcctgagccacc2580aaagctagaacaggatgcactccccactgctgccttgtgtggtatgcctttaaagtttgg2640gttccaaattagctgttttggtttctgtcacaggacaaccaattgaaaacagctcaacct2700ttcaggatagaggatggagctaacctgtagagaactaaatgatggttgttatgcaaaggt2760aggatttttaacatcacatatgaatagtcttcggaatatttcctgttgttttcatccaga2820tttgtcattactgctagtttttgaggttaggaaaagagagctgtcaccttcatggggctt2880aaaaaaatacaatgtggagattttcagtcagttttcagtcagaggaaggaataccggctg2940tccgtctagtttgaattcttcatgatggtatccttagccatgatccattgctcttgtttt3000gattatttgtattttaaagagcagattgatgcaatgggctagtgagggcattctacccta3060ttttgagagtttgagagcttcacttttttaaactaagaatgatagtgagtttaaaaaata3120ttagttgtatttcaaaattaaccttaggtgtgcttgaaattttcttatgtacttcagtaa3180caacatactgggattgcaaatattgtacttttgtatactgtaaagggggagttgaaaata3240cattaaatagtaaaaaaaaaaaaaaaaagacttggaatctagaaatcctagtttgtataa3300tggattgtaagaacttcagaaggatgaaggagttgggccctatgctctgtaaatatgttg3360attttttgctatttattgatagcttattatgtgcggaattttacatagtctggatcttca3420tagacttcctccttgaatctcctgtgtgcacttgaacgtttgtattgcctgattttacag3480atgatgacattgaagtgcagtgaggtctagtagtctttccaaggccctaagtttcacgta3540tgtcccagcagataaagttgcaaattgatgtaactgtcagcctgggggacatgggaaccc3600accagggcccttgaagaaggagaccttggcctttgtacctcctatcaatgctacccctct3660ccagctttcagcctagagtttaagagcaaacaggacatcttattctgaataaatggtact3720actaatacaaagttatttgaaaatatgtgttctttccagaacaggcatttcttcattagc3780aattgatttagagactctgatggtaagaataaatgcatttgtttttacctagtttgtgag3840aaaatatgcagagatgacttgggggaccacattttccagatagccctttctagcagagtt3900tgtgaggtcatggagaaaactactgtcacctacgtgtctctggctttattagtcagttaa3960agcaaatatagttgcatttacagaaatacccccaaaatgagtgacccactcagaatgctc4020tgccacctagtgtttactgggtgcctgctctgtaggatgcaactgcgtgtcatttcattt4080aatccttatgaagcactatggggaggtaatatgttcccgtaatacaacagaagacactga4140ggttcagggtggtagactcacttgtccaaggttatcaagctgccaagtggcagcaccaga4200atgaccccagttgatttttctgaagagccagagatcttaactccagtggaatgaaccagg4260gagggccatggtagagaaaagtcgtgctggaccttgaagaattggaaggaatattttaat4320tagagaggccggggtctggggaagagagaagacagagagggaagggtgtcctgggggtac4380tgatggcttaaagaagggcacagtggaggtgtaaagttcatgtaagaggcagagcctggc4440cttctctgactagggcactggatttggataagatgtggttctcaccctgggctctgaggc4500cccctacacccacagaggtggcctgagaggcagcctcccaggaaaggaagacactgtgag4560agtgagactctctccctgcatgcaccagcaaaggggctcagcttatgatactttagagtt4620tcaggaaaagcttt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