冠突散囊菌及其应用、黑茶及其加工方法与流程

本发明涉及微生物及食品生物技术领域，且特别涉及一种冠突散囊菌及其应用、黑茶及其加工方法。

背景技术：

茯砖茶是黑茶类的一个颇具特色的黑茶产品，是黑茶经过紧压后形成的再加工茶类，属于后发酵茶，具有降脂减肥、抗氧化、抑菌、抗肿瘤和调节免疫功能等多种保健功效，受到消费者的广泛热爱。

茯砖茶中优势菌株“冠突散囊菌”在发花过程中大量产生，对茯砖茶品质影响很大，其含量是评价茯砖茶品质的重要指标。目前茯砖茶的生产通过自然发花完成，但自然发花周期长，且容易发花不均匀，对茯砖茶品质影响很大。市售茯砖茶压制成砖型，重量较大，具有饮用不方便的问题。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种冠突散囊菌，该冠突散囊菌活性较高，能够用于接种发花生产黑茶。

本发明的第二目的在于提供一种上述冠突散囊菌在黑茶加工中的应用，可提高黑茶的发花率，促进多酚物质的转化。

本发明的第三目的在于提供一种黑茶的加工方法，该加工方法简单易操作，成本低，成品质量好，能够解决现有黑茶中茯砖茶饮用不便的问题。

本发明的第四目的在于提供一种由上述加工方法加工而得的黑茶，该黑茶发花稳定，多酚物质转化率较高，茶汤色泽较佳。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明提出一种冠突散囊菌，其生物保藏编号为：cctccno：m2017355，该冠突散囊菌于2017年6月21日保存于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为中国武汉的武汉大学。

本发明还提出一种上述冠突散囊菌在黑茶加工中的应用，优选地，上述黑茶为茯砖茶。

本发明还提出一种黑茶的加工方法，包括以下步骤：将含有上述冠突散囊菌的孢子的菌悬液接种于渥堆后的茶叶原料，发酵。

优选地，上述黑茶为茯砖茶。

本发明还提出一种黑茶，由上述黑茶的加工方法加工而得。

本发明较佳实施例中冠突散囊菌及其应用、黑茶及其加工方法的有益效果是：

本发明实施例提供的冠突散囊菌活性较高，能够用于接种发花生产黑茶。将上述冠突散囊菌应用于黑茶加工中，可提高黑茶的发花率，促进多酚物质的转化。

此外，本发明实施例提供的黑茶的加工方法简单易操作，成本低，通过接种含有冠突散囊菌pw-1的菌悬液，一方面能够提高黑茶的发花率，使黑茶发花稳定，另一方面，能够促进黑茶中多酚物质转化，改善茶汤色泽，此外，上述加工方法还能够解决现有的黑茶，尤其是茯砖茶饮用不便的问题。经上述加工方法加工而得的黑茶，发花稳定，多酚物质转化率较高，茶汤色泽较佳，成品质量好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的冠突散囊菌的生物保藏信息及存活证明；

图2为本发明实施例提供的冠突散囊菌的形态特征图；

图3为本发明实施例提供的冠突散囊菌pw-1菌株的18srdna系统发育树构建图；

图4为本发明试验例1中试验组与对照组的茯砖茶于不同发酵时间下的总酚含量图；

图5为本发明试验例2中样品1-3与样品4-7的茯砖茶中儿茶素类的质量百分数；

图6为本发明试验例2中样品1-3与样品8-11的茯砖茶中儿茶素类的质量百分数。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的冠突散囊菌及其应用、黑茶及其加工方法进行具体说明。

本发明实施例提供的冠突散囊菌通过以下方式分离纯化而得：取平武茯茶砖带有“金花”(冠突散囊菌)的茶叶或茶梗接种于pda培养基，上述“金花”取自茯茶砖的不同部位。接种后，于28℃的条件下恒温培养，待菌落长出，挑选菌落于新的pda培养基划线纯化，直至得到单菌落，保存该菌种。

值得说明的是，上述“金花”为冠突散囊菌，其能分泌多种胞外酶，可促进茶叶中蛋白质的降解，并能催化多酚类化合物氧化从而转化为对人体有益的物质，提高茶汤的口感和功效。

经鉴定，本发明实施例中的菌种属于冠突散囊菌，具体名称为冠突散囊菌pw-1(eurothumcristatumpw-1)，并于2017年6月21日在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2017355。本实施例所用的冠突散囊菌的生物保藏信息以及存活证明请参见图1。

对该菌进行形态学观察，具体地，采用三点接种法，将分离得到的冠突散囊菌pw-1分别于pda培养基以及ca培养基中培养21d(28℃的条件下恒温培养)并观察生长情况。其中，pda培养基的配制方法可以如下：取5g马铃薯浸粉、20g葡萄糖、20g琼脂和0.1g氯霉素与1l水混合而得。ca培养基的配制方法可以如下：取3g亚硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、0.5g氯化钾、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖以及20g琼脂与1l水混合，调节培养基体系的ph至5.0-5.5。

请参照图2a与图2b，其中，图2a为冠突散囊菌pw-1在pda培养基中培养7d时菌落的正面形态图，图2b为冠突散囊菌pw-1在pda培养基中培养7d时菌落的反面形态图。经培养，冠突散囊菌pw-1在pda培养基中的生长情况如下所述：培养2d时培养基中长出菌落。7d时菌落直径为15-16mm。14d时菌落直径为26-29mm，形状近圆形，中心凸起，菌落周边有一圈白色至浅黄色丝绒状菌丝体，中心部分颜色较深，近橄榄褐色；菌落周围有明显的金黄色色素扩散于基质中，呈现大量黄色具饰菌丝，老后变成褐色。21d时菌落直径为38-41mm，菌落颜色加深，外围几乎无菌丝，未见分生孢子；菌落表面粗糙致密，外围有少数金黄色斑点，菌落背面有内凹沟壑，色素将整个培养基染成黄色。

请参照图2c与图2d，其中，图2c为冠突散囊菌pw-1在ca培养基中培养7d时菌落的正面形态图，图2d为冠突散囊菌pw-1在ca培养基中培养7d时菌落的反面形态图。冠突散囊菌pw-1在ca培养基中的生长情况如下所述：开始生长缓慢，7d时菌落直径为17-21mm，14d时菌落直径为27-29mm；菌落近圆形，平坦较致密，外围丝绒状菌丝呈橄榄浅黄色，菌落中间颜色较外围深，老后菌落逐渐由黄色变为褐色。随培养时间增加，菌落表面产生分生孢子结构，呈褐色，菌株产生黄色色素扩散于基质中，菌落反面黄褐色。

进一步地，为了对冠突散囊菌pw-1的孢子进行有效观察，本发明实施例中还将分离得到的冠突散囊菌pw-1分别于cz20培养基以及cz40培养基中培养21d(28℃的条件下恒温培养)并观察生长情况。较佳地，取培养时间为4d至7d的ca、cz20以及cz40三种培养基上的菌株于光学显微镜下进行显微镜观察。

具体操作如下：于洁净载玻片上，滴1-2滴乳酸酚棉蓝染色液，用接种环从菌落边缘外取少量带有孢子的菌丝置于染色液中，再将菌丝挑散开，盖上盖玻片于显微镜下从低倍镜到高倍镜进行观察，并拍照记录。其结果如图2e-图2h所示，图2e-图2h分别代表光学显微镜下冠突散囊菌pw-1的菌丝、分生孢子梗、子囊果和子囊孢子形态图(×40)。形态如下所述：冠突散囊菌pw-1的分生孢梗茎较长，壁光滑；菌丝有隔，呈不对称分枝；顶囊呈烧瓶形，瓶梗着生于顶囊上半部；分生孢子椭圆形，少数近球形；子囊孢子椭圆形呈黄色，和分生孢子头大量混合在一起，子囊果多呈球形。

进一步地，收集培养时间为7d的ca、cz20以及cz40三种培养基上的菌体于扫描电镜下观察。其中，cz20培养基与ca培养基的唯一区别在于前者培养基中蔗糖含量为200g，cz40培养基与ca培养基的唯一区别在于前者培养基中蔗糖含量为400g。镜检的具体操作如下：用0.1mol/l的磷酸缓冲液(na⁺)洗涤菌体，离心后加入4wt％戊二醛溶液，于4℃的条件下固定8-20h，再次离心，并加入2wt％戊二醛溶液，于4℃的条件下再次固定1-2h，然后用0.1mol/l的磷酸缓冲液洗涤，离心，收集菌体。依次用30wt％、50wt％、70wt％、85wt％、95wt％和100wt％的乙醇溶液对收集而得的菌体进行梯度脱水，每次洗脱10-15min，于co2临界干燥后镜检。

其结果如图2i-图2l所示，其中图2i-图2k分别代表扫描电镜倍数分别为3000、3000和2000下冠突散囊菌pw-1分生孢子梗的形态图，图2l为扫描电镜倍数为7000下冠突散囊菌pw-1分生孢子的形态图。形态如下所述：冠突散囊菌pw-1菌株生长旺盛的气生菌丝中有大量的分生孢梗茎结构，壁光滑，测得大小为64-140μm×58μm；孢子梗末端顶囊呈烧瓶形或近球形，直径10-21μm，大部表面可育；瓶梗直接从顶囊上产生，密集分布在顶囊的上半部，大小3-8.5μm×1.8-3μm，产孢结构单层；瓶梗成熟后，分生孢子直接从瓶梗顶端以出芽方式发育，随着分生孢子的成熟，下端的分生孢子开始发育，有串生孢子形式出现，产孢位置不变，成熟后脱落，瓶梗处有孔；分生孢子呈椭圆形，两端平截，表面粗糙，具小刺，大小为4-5.5μm×3.2-4.3μm；分生孢子头幼时呈近球形，老后呈疏松放射形，大小为25-60μm，电镜下未观察到有性生殖结构。

进一步地，对冠突散囊菌pw-1菌株的18srdna进行分子生物学鉴定，具体包括如下步骤：选用引物ns1和ns8进行扩增，对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统拍照；将纯化后的pcr产物进行序列测定，结果提交至ncbi数据库中进行同源比对，选取同源性较高的序列，利用mega分析软件对序列进行分析，并进行系统发育树构建，其结果如图3所示。其中，引物ns1和引物ns8的碱基序列分别为：5’-gtagtcatatgcttgtctc-3’和5’-tccgcaggttcacctacgga-3’。由图3可以看出，冠突散囊菌pw-1菌株与冠突散囊菌同源性最高，相似性为99％。综合本发明实施例中菌株pw-1的形态学特征和分子生物学鉴定结果，确定本发明菌株为冠突散囊菌，并命名为上述冠突散囊菌pw-1。

上述分离而得的冠突散囊菌pw-1可应用于黑茶加工中，以提高黑茶的发花率，促进多酚物质的转化。作为可选地，本发明实施例中的茶叶原料例如可以包括茯砖茶茶叶、康砖茶茶叶、金尖茶茶叶和六堡茶茶叶等。优选地，冠突散囊菌应用于黑茶中的茯砖茶，可明显提高茯砖茶的发花率，使茯砖茶稳定发花。

本发明实施例中还提供了一种黑茶的加工方法，例如可以包括以下步骤：将含有上述冠突散囊菌pw-1的孢子的菌悬液接种于渥堆后的茶叶原料，发酵。优选地，上述黑茶为茯砖茶。

其中，菌悬液由无菌水与冠突散囊菌pw-1的孢子混合而得。优选地，每毫升菌悬液中含有1×10⁶-2×10⁶个冠突散囊菌pw-1的孢子；更优地，每毫升菌悬液中含有1.5×10⁶个冠突散囊菌pw-1的孢子。较佳地，每千克茶叶原料接种40-80ml上述菌悬液，更佳地，每千克茶叶原料接种60ml上述菌悬液。

渥堆例如可于45-55℃的条件下堆放16-20h，优选于50℃的条件下堆放18h。本发明实施例中，渥堆前，还包括将茶叶原料于95-100℃的条件下汽蒸20-30min，优选于100℃的条件下汽蒸25min，经此优选汽蒸条件汽蒸后的茶叶叶质柔软无刺手感。

接种菌悬液后，发酵可于26-30℃的条件下进行20-22天，优选于28℃的条件下恒温发酵21d。

按上述优选的接种量与发酵条件可使黑茶，尤其是茯砖茶的发花程度达到最佳，同时还能提高多酚物质的转化率。并且，通过上述加工方法，可避免所得的黑茶重量较大，不利冲泡及饮用的问题。值得说明的是，根据不同的黑茶品种以及具体情况，还可通过调节加工过程中的接种量以及发酵时间来控制黑茶的发花程度。

本发明实施例还提供了由上述加工方法加工而得的黑茶，该黑茶发花稳定，多酚物质转化率较高，茶汤色泽橙黄透亮，品质好。此外，所得的黑茶较普通常见的黑茶更加小型，也即重量更轻，利于冲泡及饮用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

将无菌水与冠突散囊菌pw-1的孢子混合，得到菌悬液。每毫升上述菌悬液中含有1×10⁶个冠突散囊菌pw-1的孢子。

取康砖茶茶叶于95℃的条件下汽蒸30min，然后于45℃的条件下渥堆20h。

于渥堆的康砖茶茶叶的表面按每千克茶叶接种40ml上述菌悬液的比例进行接种。然后于26℃的条件下发酵22天，得到成品康砖茶。

实施例2

将无菌水与冠突散囊菌pw-1的孢子混合，得到菌悬液。每毫升上述菌悬液中含有2×10⁶个冠突散囊菌pw-1的孢子。

取金尖茶茶叶于100℃的条件下汽蒸20min，然后于55℃的条件下渥堆16h。

于渥堆的金尖茶茶叶的表面按每千克茶叶接种80ml上述菌悬液的比例进行接种。然后于30℃的条件下发酵20天，得到成品金尖茶。

实施例3

将无菌水与冠突散囊菌pw-1的孢子混合，得到菌悬液。每毫升上述菌悬液中含有1.5×10⁶个冠突散囊菌pw-1的孢子。

取六堡茶茶叶于98℃的条件下汽蒸25min，然后于50℃的条件下渥堆18h。

于渥堆的六堡茶茶叶的表面按每千克茶叶接种60ml上述菌悬液的比例进行接种。然后于28℃的条件下发酵21天，得到成品六堡茶。

实施例4

将无菌水与冠突散囊菌pw-1的孢子混合，得到菌悬液。每毫升上述菌悬液中含有1.5×10⁶个冠突散囊菌pw-1的孢子。

取茯砖茶茶叶于100℃的条件下汽蒸25min，然后于50℃的条件下渥堆18h。

于渥堆的茯砖茶茶叶的表面按每千克茶叶接种60ml上述菌悬液的比例进行接种。然后于28℃的条件下发酵21天，得到成品茯砖茶。

试验例1

重复实施上述实施例1-4，得到足够多的成品康砖茶、成品金尖茶、成品六堡茶和成品茯砖茶。以实施例4作为试验组，设置对照组，对照组与试验组的区别在于对照组以等量无菌水代替试验组中的菌悬液进行自然发酵。对比试验组与对照组的茯砖茶于不同发酵时间下的总酚含量(mg/g)，总酚含量测定按《gb/t8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测》方法进行测定，其结果如图4所示。图4中“**”代表该发酵时间下试验组与对照组的样品之间的差别具有极显著差异。

由图4可以看出，随发酵时间增加，对照组与试验组的总酚含量整体上均呈现下降趋势，且同一发酵时间下，试验组茯砖茶的总酚含量均较对照组茯砖茶的总酚含量更低，说明试验组较对照组的茯砖茶的多酚物质转化率更高。

试验例2

以实施例4为例，设置1-11样品组，其中样品1为实施例4的茯砖茶茶叶原料，样品2为实施例4中汽蒸25min后的茶叶原料，样品3为实施例4中渥堆18h后的茶叶原料，样品4至样品7分别为实施例4经自然发酵7d、10d、15d和21d后的茯砖茶，样品8至样品11分别为实施例4经接种发酵(接种含有冠突散囊菌pw-1的孢子的菌悬液)7d、10d、15d和21d后的茯砖茶。对比样品1至11的茯砖茶中儿茶素的质量百分数(％)，儿茶素含量测定按以下方法进行测定。具体地，测定方法中样品预处理及高效液相色谱分析条件如下：

(1)样品预处理

用70wt％的甲醇水溶液提取样品，料液比为1：20，提取时间为12h，提取过程中超声处理3次，每次20min，减压抽滤后定容，过0.22μm滤膜备用。

(2)高效液相色谱分析条件

ods-3色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相a：水(0.1wt％甲酸)；流动相b：甲醇；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；紫外检测波长：280nm。

时间洗脱程序如表1所示。

表1hplc洗脱程序

测定结果如图5及图6所示。其中，ga代表没食子酸，egc代表表没食子儿茶素，c代表儿茶素，egcg代表表没食子儿茶素没食子酸酯，ec代表表儿茶素，ecg代表表儿茶素没食子酸酯。

由图5及图6可知，自然发酵和接种发酵两种方式下，茯砖茶所含的儿茶素总量均呈下降趋势，且接种发酵样品的儿茶素总量下降程度更大。ga、egc、c、egcg、ec、ecg的含量在整个发酵过程中整体呈现下降趋势，且上述儿茶素类物质在接种发酵样品中下降程度更大。egc的含量较其他几种物质含量均更高，且在自然发酵样品与接种发酵样品中变化趋势相同。c在自然发酵样品与接种发酵样品中含量均偏低。对比自然发酵样品与接种发酵样品的结果可知，随着发酵程度的增加，儿茶素类物质持续降解，含量下降，且冠突散囊菌pw-1能够促进儿茶素类物质的降解。此结果可能与微生物在发酵过程中大量分泌胞外酶，促进儿茶素类物质发生酶促氧化，使其含量下降有关。

试验例3

取试验例2中的样品1至11，于相同条件下泡制。上述泡制条件如下：按料液比为1：50于样品中加入沸水冲泡10min。将茶汤减压抽滤后定容备用，预热色差仪并制备空白样品，校正后取2/3比色皿容积的茶汤进行色差值测定，采用hunterlab色系统，每个样品重复三次，取平均值，对不同样品所得的茶汤的l*、a*、b*值进行测定，其中，l*为亮度值，a*为红度值，b*为黄度值，测定结果如表2所示。

表2茶汤色泽

其中，△e为总色差值。由表2可以看出，泡制后的茯砖茶茶汤的红黄程度随发酵时间的增加而增加，并且接种发酵组(样品8-11)较自然发酵组(样品4-7)增加幅度更大。

承上所述，本发明实施例提供的黑茶的加工方法，通过接种含有冠突散囊菌pw-1的菌悬液，一方面能够提高茯砖茶的发花率，且能使发花稳定。经上述加工方法所得的发花第7天的发酵茯砖茶中的金花数量远大于《gb/t9833.3-2013紧压茶第3部分茯砖茶》中冠突散囊菌≥20×10⁴cfu/g的要求。另一方面，通过接种含有冠突散囊菌pw-1的菌悬液，还能促进茯砖茶中多酚物质转化，改善茶汤色泽。

此外，按照试验例1-3的方法对实施例1-3分别进行试验，其结果显示接种发酵组均较自然发酵组的茶的品质更佳。因此，本发明实施例提供的黑茶加工方法较普通加工方法(自然发酵)所得的黑茶具有更高品质和优势。

综上所述，本发明实施例的冠突散囊菌活性较高，能够用于接种发花生产黑茶。将上述冠突散囊菌应用于黑茶加工中，可提高黑茶的发花率，促进多酚物质的转化。此外，本发明实施例提供的黑茶的加工方法简单易操作，成本低，成品质量好，能够解决现有的茯砖茶饮用不便的问题。由此加工而得的黑茶，发花稳定，多酚物质转化率较高，茶汤色泽较佳。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

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<110>四川大学

<120>冠突散囊菌及其应用、黑茶及其加工方法

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