一株改善易胖体质及子代体重的植物乳杆菌及应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，更具体地说涉及一株通过调控肠道菌群控制亲代及子代体重、改善易胖体质的植物乳杆菌lp-a3及其应用。

背景技术：

随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖发生率迅速上升。根据世界卫生组织报道，1980年以来，肥胖人群的数量已经增加一倍。2014年全球有19亿超重人群。

肥胖不但威胁本人的身体健康，还对子代的健康造成威胁。国内外大量研究表明，妊娠期肥胖与许多不良妊娠结局相关，如妊娠期糖尿病、妊娠期高血压、难产、早产、剖宫产、巨大儿、产程延长等。此外，妊娠时若胎儿处于营养不良的宫内环境，胎儿为适应不良的宫内环境其营养物质代谢相关机能将会发生永久性的改变，造成特定的代谢模式。孕前体重超重的女性，容易发生新陈代谢异常，导致胚胎的神经系统发育出现畸变，生神经管畸形儿的几率是体重正常者的2倍；孕后体重超重的女性，生神经管畸形儿的几率是体重正常者的4倍。在此基础上其他类型的畸形危险亦有所增加，例如，孕前肥胖的妇女胎儿脊柱裂的危险是体重正常组的3倍多，腹壁畸形脐膨出是体重正常组的3倍多。据美国疾病控制与预防中心的研究人员报道，怀孕前体重过重的妇女分娩的婴儿比正常体重妇女分娩的婴儿更容易出现心脏缺陷。大量的研究表明妊娠期的营养状况还与子代成年后血压、血脂、血糖、胰岛素敏感性及肥胖的发生密切相关。因此，孕期合理的饮食及保健不但关系到围产期母婴的健康状态，同时关系到后代慢性病的发生和终生健康。肥胖还会导致内脏脂肪增加，内脏脂肪是人体脂肪中的一种，与皮下脂肪不同，它围绕着人的脏器，主要存在于腹腔内。内脏脂肪对于我们的健康意义重大。当内脏脂肪进入消化系统时，会对肝脏等器官造成损害，引发脂肪肝，扰乱新陈代谢，引发2型糖尿病和不孕。内脏脂肪还会增加心血管疾病几率，导致动脉炎症，甚至容易导致抑郁。内脏脂肪还会导致心脏肥大，进而使心脏泵血效率大大降低，导致气短和疲劳。肥胖者感觉呼吸更困难，就是因为当人们平躺时，腹部脂肪压迫肺脏，从而导致肥胖者躺下时感觉呼吸急促。呼吸越困难，就越容易造成血流中输氧量不足，进而导致全身乏力、免疫力受损，甚至高血压。

市场上现有的减肥产品治标不治本，影响身体健康，破坏肠道菌群平衡，扰乱代谢，容易引起反弹或产生依赖，甚至造成严重的副作用。尤其是有些生产厂家违规添加西布曲明等违禁成分，对消费者的身心健康造成巨大威胁。由于孕妇人群的特殊性，控制孕妇体重和血脂的产品需要极强的安全性，虽然市场需求很大，但是目前市场上并没有控制孕妇体重的产品。因此，市场上需要一种能从根本上改善易胖体质，安全性强可以适用于孕妇的减肥产品。

肠道菌群是寄居在肠道的正常微生物群，与宿主长期共存、共同进化，参与宿主的营养、代谢、免疫等重要的生理功能，对宿主健康具有重要的作用。近年来，研究人员发现，肠道菌群与肥胖的发生密切相关，人每天吃的食物都需要肠道菌群来处理，吸收营养物质和能量，由于肠道菌群及相关酶的不同，每个人对食物中成分的转化和吸收有很大的个体差异，所以肠道菌群直接影响着人对食物的吸收和利用，从而控制着人的胖瘦。研究发现，肠道菌群可以通过降低脂肪吸收率、抑制食欲和减少促进肥胖发生的炎症反应等，影响体重和身体健康，尤其是肠道中两种菌群“拟杆菌门”和“厚壁菌门”的平衡，直接影响人的胖瘦：与正常体重的人相比，胖人肠道中的“厚壁菌门”数量更多，“拟杆菌门”数量较少。因此，不健康的肠道菌群是造成易胖体质的重要原因，开发调节肠道菌群的益生菌产品能够通过调节肠道菌群逆转易胖体质。

植物乳杆菌是一种革兰氏阳性菌，兼性厌氧，是肠道菌群中一类非常重要的益生菌，某些菌株可以定植于肠道并发挥益生作用。植物乳杆菌安全性高，无毒副作用，效果明显，被广泛应用于食品、保健品和药品中，并适合孕妇食用。然而，在实际利用植物乳杆菌的过程中，虽然有些植物乳杆菌具备控制体重，调节脂肪代谢的作用，但是并不一定能够对子代产生有利影响，也不具有改善肠道菌群结构，逆转易胖体质的作用。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足之处，提供一株改善易胖体质及子代体重的植物乳杆菌及应用，为一株安全、有效并能通过孕妇作用于子代，又能通过调节肠道菌群结构从根本上改变易胖体质的植物乳杆菌。

本发明实现目的的技术方案如下：

一株改善易胖体质及子代体重的植物乳杆菌，植物乳杆菌保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌lactobacillusplantarum。

含上述改善易胖体质及子代体重的植物乳杆菌的生物菌剂。

含上述改善易胖体质及子代体重的植物乳杆菌的减肥食品。

含上述改善易胖体质及子代体重的植物乳杆菌的保健品。

含上述改善易胖体质及子代体重的植物乳杆菌的孕妇食品。

本发明的优点和积极效果如下：

本菌种具有优秀的耐酸耐胆盐能力、胆盐水解酶活性和肠道定植能力，动物实验和人体试食实验表明，该菌能够通过胆盐水解酶活性和调节肠道菌群控制高脂高糖饮食引起的孕妇和子代体重增加，同时，该菌能够调节肠道菌群，优化肠道菌群结构，增加有益菌数量，改善拟杆菌门和厚壁菌门比例，从而改善易胖体质。动物实验和人体试食实验均证明，该菌功效明确、安全性高，能够通过从根本上改善人的肠道菌群来逆转易胖体质，作用持久不反弹，具有巨大的市场开发潜力。

附图说明

图1植物乳杆菌lp-a3对大鼠体重的影响。

图2各组子代鼠体质量、lee’s指数比较，a：与空白对照组比较，p＜0.05b：与模型组比较，p＜0.05。

图3植物乳杆菌lp-a3对母鼠脂代谢的影响，a：与对照组比较，p＜0.05b：与模型组比较，p＜0.05。

图4植物乳杆菌lp-a3对子代脂代谢的影响，a：与对照组比较，p＜0.05b：与模型组比较，p＜0.05。

图5植物乳杆菌lp-a3对大鼠肾周脂肪和肾周脂肪指数的影响，a：与对照组比较，p＜0.05b：与模型组比较，p＜0.05。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明提供一株新分离的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)lp-a3，该植物乳杆菌保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.14570，保藏日期为2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌lactobacillusplantarum。

本菌株lp-a3分离自18-22周岁健康未婚女性运动员体内(中国北京)，具有优秀的耐酸耐胆盐能力、胆盐水解酶活性和肠道定植能力，动物实验和人体试食实验表明，该菌能够通过胆盐水解酶活性和调节肠道菌群控制高脂高糖饮食引起的孕妇和子代体重增加，同时，该菌能够调节肠道菌群，优化肠道菌群结构，增加有益菌数量，改善拟杆菌门和厚壁菌门比例，从而改善易胖体质。动物实验和人体试食实验均证明，该菌功效明确、安全性高，能够通过从根本上改善人的肠道菌群来逆转易胖体质，作用持久不反弹，具有巨大的市场开发潜力。本菌株的筛选、分离、鉴定过程如下：

1.植物乳杆菌lp-a3的分离及鉴定

1.1菌株样品：采集自18-22周岁未婚健康女性运动员体内。

1.2培养基：mrs培养基(manrogosasharp，mrs)，乳酸菌选择性培养基。

蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐温801.0ml磷酸氢二钾2.0g乙酸钠5.0g柠檬酸二铵2.0g硫酸镁0.2g硫酸锰0.05g琼脂粉15.0g蒸馏水1000ml

1.3菌种分离纯化：

用无菌棉棒取样，样品溶于适量mrs培养基中，用灭菌吸管吸取1ml培养液加入装有9ml无菌水的试管中(1:10)稀释，同法连续稀释成几个梯度的稀释液。取0.1ml三个适当稀释梯度的菌液涂于mrs琼脂平板培养基上，每个稀释度做3个平行试验。将培养皿倒置于生化培养箱内，37℃培养。

待菌落形成后，记录菌落形态，用接种环挑取单个菌落，纯化，到镜检不存在混杂菌为止。

将已经分离纯化的菌株转接到mrs斜面上，贴好标签，4℃下保藏。

1.4菌种鉴定

参照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》,并对菌株lp-a3进行16srdna测序。经对比鉴定为植物乳杆菌lactobacillusplantarum。

16srdna测序结果如下：

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2.耐胃液模拟实验

配制胃蛋白浓度为3.2g/l的mrs液体培养基(盐酸调节)，将活化好的植物乳杆菌以6％接种量接种于10mlph自然和ph2的上述培养基，37℃培养4h。连续稀释成适宜梯度的稀释液，计数。

3.耐肠液模拟实验

配制胰蛋白酶浓度为10g/l的mrs液体培养基，将活化好的植物乳杆菌以6％接种量分别接种于10ml含有0.15％和0.3％牛胆酸钠的上述培养基，37℃培养24h。连续稀释成适宜梯度的稀释液，计数。

4.胆盐水解酶活力定性检测

在mrs液体培养基中添加0.3％脱氧牛磺胆酸钠、0.2％巯基乙酸钠(thio)、0.37g/lcacl2和1.5％琼脂，121℃15min灭菌后倾倒入灭菌平皿中，凝固后倒置放入厌氧罐(bbl)中48h后取出。将无菌滤纸片放入平皿中，每个滤纸片上滴加10μl菌液，平皿再次放入厌氧罐中，37℃培养72h。观察滤纸片周围有无白色沉淀物生成。

5.动物实验

5.1.实验动物：雌性sd大鼠，体重为180±10g

5.2.实验分组及治疗

30只雌鼠按体重随机分为对照组、模型组和益生菌组，每组10只。对照组给予生理盐水灌胃，模型组给予2ml/1000g体重的高脂乳剂和生理盐水灌胃，益生菌组给予2ml/1000g体重的高脂乳剂和益生菌液灌胃，各组均给予标准饲料自由采食，连续饲养6周，定期监测体重变化。6周后按雌雄2:1比例合笼，次日晨检查阴栓确定怀孕。孕17d前每笼饲养3-4只，孕17d分笼，每笼饲养孕鼠1只。分娩后母乳喂养，防止哺乳只数不同对血脂的影响，生后3d处死多余子鼠，使每窝子鼠数为6只，雌雄各半。母乳喂养21d。然后牺牲母鼠和子鼠称重，取血。

益生菌液配制：活化好的植物乳杆菌加入冻干保护剂，冻干成菌粉并计数，将一定量的菌粉重悬于生理盐水中配制成一定浓度的菌液进行灌胃。灌胃剂量：5.0×107cfu/100g体重。

5.3实验指标

5.3.1体重、体长

每周称量一次体重及体长(身长为鼻尖至肛门的距离)。并按以下公式计算lee’s指数：lee’s指数＝体重(g)^(1/3)×1000/体长(cm)，反映动物的肥胖程度。体质量(bmi)＝体重(kg)÷身高^2(m)，是衡量胖瘦程度以及是否健康的一个标准。

5.3.2血脂

子代大鼠母乳喂养21d，禁食10h后心脏取血，采用试剂盒检测血清tg(甘油三酯)、tc(总胆固醇)、ldl-c(低密度脂蛋白)、hdl-c(高密度脂蛋白)等生化指标。母鼠牺牲前禁食10h后心脏取血，检测上述指标。

5.3.3肾周脂肪指数

母乳喂养21d后，牺牲母鼠，分离肾周脂肪并称重，计算肾周脂肪指数：肾周脂肪指数＝肾周脂肪重量(g)/体重(g)×100％。

6.人体试食实验

采用自身对照的试验设计，选择年龄在25-50岁之间、符合纳入标准并保证配合试验的志愿者15名，食用植物乳杆菌lp-a3菌粉：活菌数为1×1010cfu/d，15天，实验开始前后分别取粪便样品，进行肠道菌群检测。实验期间不改变原来的饮食及其他生活习惯。

检测结果

1.植物乳杆菌lp-a3的分离及鉴定

植物乳杆菌lp-a3的形态学观察结果如表1。

表1植物乳杆菌lp-a3的形态学观察

将菌株lp-a3的16srdna序列与genbank中已知序列进行blast比对,从数据库中获得相关的种属的16srdna,构建系统发育树，并通过菌种的细胞形态、生理生化特征和16srdna序列等实验数据综合确定该菌株属于乳杆菌属，最终确定为植物乳杆菌。

2.耐胃液模拟实验结果

植物乳杆菌lp-a3在ph为2和2.5的条件下4h后的存活率如表2所示。结果表明该菌具有较强的耐酸能力，能耐受胃液的消化。

表2植物乳杆菌lp-a3耐酸能力

3.耐肠液模拟实验结果

植物乳杆菌lp-a3在含有牛胆酸钠的培养基中37℃培养24h后的存活率如表3所示。结果表明该菌具有较强的耐胆盐能力，能通过消化道抵达肠道。

表3植物乳杆菌lp-a3耐胆盐能力

4.胆盐水解酶活力检测结果

由于胆盐水解酶可以水解结合态胆盐，将其转变为氨基酸和游离胆酸，游离胆酸可以和培养基中的cacl2反应，产生白色沉淀。因此，含有胆盐水解酶活性的乳酸菌会在滤纸片周围产生白色的沉淀圈。植物乳杆菌lp-a3能在滤纸片周围产生明显的白色沉淀，表示此菌株具有胆盐水解酶活性，具有降低血液中胆固醇水平的潜力。

5.动物实验结果

5.1体重、体长

各组大鼠体重比较如图1，模型组体重高于对照组和益生菌组，差异有统计学意义(p<0.05)。说明植物乳杆菌lp-a3干预能有效改善大鼠体重，见图1。

各组子代大鼠体重和lee’s指数比较结果如图2所示，模型组体重和lee’s指数显著高于对照组和益生菌组(p<0.05)。益生菌组与对照组差异不大，lee’s指数能够客观反映大鼠肥胖情况，实验结果表明，植物乳杆菌lp-a3干预有利于减轻因母代大鼠高脂高糖饮食引起的子代体重增加，见图2。

5.2血脂

检测母鼠血清总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白(ldl-c)、高密度脂蛋白(hdl-c)和甘油三酯(tg)，血脂化验结果见图3，对照组tc、ldl-c和tg均低于模型组，hdl-c浓度则要高于模型组，差异均有统计学意义(p＜0.05)。说明建模成功。益生菌组表现出了体内降低tc、ldl-c和tg的能力，差异均有统计学意义(p＜0.05)，益生菌组hdl-c浓度高于模型组，表现出具有提高体内hdl-c浓度的能力。说明该菌可以有效改善母鼠脂质代谢水平。

植物乳杆菌lp-a3干预有利于改善怀孕母鼠高脂高糖饮食造成的子代脂代谢紊乱。如图4所示，与对照组相比，模型组所产子代血清总胆固醇含量、低密度脂蛋白含量明显增高，益生菌组与对照组无显著性差异，与肥胖组血清总胆固醇含量、低密度脂蛋白含量、tc/hdl及ldl/hdl比值比较，均低于模型组，差异均有统计学意义。实验数据表明，高脂高糖饮食诱导的肥胖母鼠所产子代存在脂代谢紊乱，植物乳杆菌lp-a3干预有利于调整子代脂代谢紊乱。

5.3.3肾周脂肪指数

母鼠牺牲后，分离肾周脂肪并称重，计算肾周脂肪指数，结果如图5所示，模型组肾周脂肪重量和肾周脂肪指数显著高于对照组(p<0.05)，差异有统计学意义；益生菌组明显低于模型组，差异有统计学意义(p<0.05)。研究数据表明植物乳杆菌lp-a3能够有效减小肾周脂肪重量和肾脏脂肪指数，说明该菌能够有效抑制内脏脂肪生成。

6.人体试食实验结果

表4植物乳杆菌lp-a3人体试食实验结果

如表4所示，试食植物乳杆菌lp-a3菌粉后，所有样本的拟杆菌门、厚壁菌门的比值均有所升高。肠道菌群主要有9个门的菌群，其中98％的细菌可归于以下四个门，拟杆菌群、厚壁菌群、变形菌群、放线菌群。研究发现，肥胖者肠道菌群中拟杆菌门、厚壁菌门的比例较之体质量正常者明显降低。拟杆菌门、厚壁菌门的比值升高，说明肥胖的风险降低；双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。双歧杆菌属和乳酸菌属两种益生菌均有所提高，说明植物乳杆菌lp-a3可以调节肠道环境，增加肠道菌群中有益菌比例。

植物乳杆菌lp-a3具有优秀的耐酸耐胆盐能力，证明植物乳杆菌lp-a3经口摄入后，能够顺利经过消化道到达肠道，发挥益生作用。动物实验结果表明，该菌具有较强控制体重、预防肥胖和改善脂质代谢的作用，可以有效降低内脏脂肪含量并可明显改善孕期及其子代的体重和脂质代谢。人体实验证明，植物乳杆菌lp-a3能够通过调节肠道菌群中拟杆菌和厚壁菌门的比例、增加肠道有益菌比例，达到预防肥胖，逆转易胖体质的目的，在研究中发现，该菌株安全性高，效果明确。

综上所述，本菌不仅具有较强的耐酸、耐胆盐特性，还具有以下三大特点：

1、可以通过母体摄入改善子代体重和脂肪代谢；

2、减少脂肪吸收，减少内脏脂肪积累；

3、通过调节肠道菌群结构，改善易胖体质。

因此，植物乳杆菌lp-a3在减脂、减肥相关保健品、食品和药品的开发应用中，尤其是孕妇产品的开发中，具有很大应用潜力。

序列表

<110>天津科睿恒生物科技有限公司

<120>一株改善易胖体质及子代体重的植物乳杆菌及应用

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