一种江珧贝壳DNA提取方法、鉴定引物及试剂盒与流程

本发明涉及dna提取技术领域，具体涉及一种江珧贝壳dna提取方法、鉴定旗江珧或栉江珧引物及包含所述引物的试剂盒。

背景技术：

江珧，在分类上属于双壳纲(bivalvia)、贻贝目(mytiloida)、江珧科(pinnidae)，是一类经济价值较大的大型海产软体动物。江珧科是一个暖水性科，至今在世界上已发现约30种，主要分布在热带和亚热带海区。江珧的后闭壳肌肉嫩味美，营养丰富，干制品可以制成一种极为名贵的海珍品“江珧柱”。栉江珧与旗江珧是两种常见的经济种；栉江珧属栉江珧属，产量较大，壳形较长且壳薄，主要分布在日本、中国大陆、中国台湾等地区；旗江珧也属栉江珧属，壳中型到大型且壳厚，主要分布在印度、日本、菲律宾、印度尼西亚、波利尼西亚、非洲东部沿海等地区；二者形态差异较大。近年来，对江珧的研究工作逐步由研究其个体和种群转移到对其遗传学以及分子生物学的研究。

在进行分子育种以及群体遗传学研究中，通常需要对个体进行基因序列分析，以获得相关的遗传信息。对于分子生物学的研究，首要任务就是提取高质量的dna，提取dna的质量对于后期的研究分析以及育种筛选具有重要的影响。dna的提取过程是从个体本身获取一定的组织，将细胞粉碎，去除与dna结合的蛋白质、多糖和脂类，最终通过分离纯化得到所需的dna。

对于软体动物而言，传统的dna提取方法是是剖取软体动物部分组织，进行dna的提取。但是，这种方法对软体动物个体具有较大的伤害，剖取组织后对个体伤害较大，导致个体的成活率很低，对后续软体动物个体的观察以及发育有较大的影响，并且具有很大的死亡比例。所以，活体取样组织进行dna的提取，并不是软体动物无损伤提取dna进行基因序列分析的最佳手段。

目前，贝类的分子育种工作尚未开展，其中一个主要困难就是种贝的活体取样工作难以有效开展。首先，因为大多数贝类具有以保护其软体部的坚硬外壳，并且非常不易打开，这给取样造成了困难；其次，部分贝类(如扇贝)的双壳虽然会经常打开，但软体部取样后也往往具有较高的死亡率，不利于种贝资源的养护和利用；因此，寻找到高效、适宜的贝类活体基因组dna提取方法，可为贝类分子育种和分子鉴定奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种江珧贝壳dna提取方法，该方法只利用江珧贝壳少量的腹缘贝壳，就成功提取到了江珧线粒体基因组和核基因组，这种方法对贝壳的软体无损伤，为贝类分子育种中个体基因和基因型的分子检测提供了可靠途径。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种江珧贝壳dna提取方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将江珧贝壳用去离子水浸泡冲洗后，用刷子洗刷干净，去掉表面的杂质及组织残留，置于电热鼓风干燥箱中65℃烘干6h，直到贝壳完全烘干；

(2)从江珧贝壳的腹缘取少量贝壳样本(约100mg)，用砂纸将贝壳样本的最外层磨掉，粉碎成粉末；

(3)过滤后的粉末转入灭菌的1.5mlep管中，再加入1000μl的edta后，置于摇床中脱钙24小时，脱钙处理后将样品置于离心机中以4000rpm的转速离心15分钟，弃滤液，用50μl去离子水洗涤沉淀，以去除脱钙残留下来的盐离子；

(4)重复用50μl去离子水洗涤沉淀两次，然后加600μl、ph值为8.0的tris-hcl和20μl蛋白酶k，56℃温度条件下，消化6小时；

(5)加入600μl的抽提液，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至另一个1.5mlep管中，再继续用等体积的抽提液再抽提一次，12000rpm离心10分钟，收集上层水相；

(6)加入600μl的氯仿，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至新的1.5mlep管中，加入-20℃预冷的等体积的异丙醇，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，弃上清，然后用50μl，75％乙醇洗涤沉淀，重复洗涤一次；

(7)将ep管置于通风处晾干后，用5μl去离子水溶解dna样品。

其中，步骤(2)中的粉碎成粉末的方法为：首先用锤子将贝壳样本砸碎，用镊子挑取贝壳内层的发亮片状棱柱层，置于经灭菌水清洗并烘干的研钵中，研碎成粉末，然后，用孔径为0.8mm的纱布过滤后得粉末。

进一步地，步骤(3)所述edta的ph值为8.0，摇床的温度为37℃，振荡速度为200rpm。

进一步地，步骤(5)中所述抽提液为苯酚-氯仿-异戊醇＝25∶24∶1。

以上方法适合所有的江珧贝壳，尤其适用于旗江珧或栉江珧贝壳。

本发明还公开了用于旗江珧贝壳鉴定的引物，包括如下3对引物对：

引物对1——正向引物的序列如seqidno.1所示，反向引物的序列如seqidno.2所示；

引物对2——正向引物的序列如seqidno.3所示，反向引物的序列如seqidno.4所示；

引物对3——正向引物的序列如seqidno.5所示，反向引物的序列如seqidno.6所示。

还公开了栉江珧贝壳鉴定的引物，包括如下3对引物对：

引物对4——正向引物的序列如seqidno.7所示，反向引物的序列如seqidno.8所示；

引物对5——正向引物的序列如seqidno.9所示，反向引物的序列如seqidno.10所示；

引物对6——正向引物的序列如seqidno.11所示，反向引物的序列如seqidno.12所示。

包含上述旗江珧或栉江珧贝壳鉴定引物的试剂盒均落入本发明的保护范围之内。

本发明方法具有如下优点：

本发明所述的江珧贝壳无损伤dna提取方法，只选取江珧贝壳腹缘部100mg左右的少量贝壳作为提取样品，研碎贝壳后加入edta溶液对贝壳粉末进行脱钙，然后，进行蛋白消化，释放dna，再加入抽提液将蛋白质、多糖以及脂类等杂质与dna分离，即可得到用于分子生物学实验以及遗传育种检测的dna样品。整个过程操作简单且快速，提取的dna质量较好并且能长期保存。取样部位来自贝壳边缘，不伤害个体，尤其适用于群体遗传学分析及分子标记，为群体遗传学分析及分子育种提供了一种新的dna提取方法。

该方法只利用江珧少量的腹缘贝壳，经过试验验证，成功提取到了江珧线粒体基因组和核基因组，说明贝壳中dna包含了其本身所有的遗传信息，为贝类分子育种中个体基因和基因型的分子检测提供了可靠途径。此外，此种方法对种贝无损伤，为贝类特别是大型贝类的分子育种工作奠定了基础。

附图说明

图1是用来提取dna贝壳样品的取样所在位置。

图2是提取的总基因组dna凝胶电泳图谱；

图中，m：trans2kdnamarker(100-2000bp)，1：旗江珧(a.vexillum)总基因组电泳图谱，2：栉江珧(a.pectinata)总基因组电泳图谱。

图3是coi基因的pcr扩增电泳图谱；

图中，m：trans2kdnamarker(100-2000bp)，1：旗江珧(a.vexillum)coi.dna的pcr扩增电泳图谱，2：栉江珧(a.pectinata)coi.dna的pcr扩增电泳图谱。

图4是rrna基因的pcr扩增电泳图谱；

图中，m：trans2kdnamarker(100-2000bp)，1：旗江珧(a.vexillum)28srrnapcr扩增电泳图谱，2：旗江珧(a.vexillum)18srrnapcr扩增电泳图谱，3：栉江珧(a.pectinata)28srrnapcr扩增电泳图谱，4：栉江珧(a.pectinata)18srrnapcr扩增电泳图谱。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例1

本实施例以旗江珧和栉江珧为例详细叙述本发明。

1、试验材料

材料来源：旗江珧贝壳采集于广西北海涠洲岛，栉江珧贝壳采集于广西湛江。每种江珧壳各采集50个，旗江珧壳均重约为70.1g，壳长约10.7cm，壳宽约3.0cm，壳高约17.1cm；栉江珧壳均重约为39.3g，壳长约12.5cm，壳宽约4.2cm，壳高约23.1cm。

2、对贝壳dna进行提取

(1)贝壳用去离子水浸泡冲洗后，用刷子洗刷干净，去掉表面的杂质及组织残留，置于电热鼓风干燥箱中65℃烘干6h，直到贝壳完全烘干；

(2)从从江珧贝壳的腹缘(新生壳处)取少量贝壳样本，用砂纸将贝壳样本的最外层磨掉，粉碎成粉末；所述贝壳的腹缘部位见图1；

(3)粉碎后转入1.5mlep管中，每管分装约100mg贝壳粉；再加入1000μl的edta(ph8.0)后，置于摇床(37℃，200r/m)中脱钙24小时，脱钙处理后将样品置于离心机中以4000rpm的转速离心15分钟，弃滤液，用50μl去离子水洗涤沉淀，以去除脱钙残留下来的盐离子；

(4)重复用50μl去离子水洗涤沉淀两次，然后加600μl、ph值为8.0的tris-hcl(ph8.0)和20μl蛋白酶k，56℃温度条件下，消化6小时；

(5)加入600μl的抽提液(苯酚-氯仿-异戊醇＝25∶24∶1)，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至另一个1.5mlep管中，再继续用等体积的抽提液再抽提一次，12000rpm离心10分钟，收集上层水相；

(6)加入600μl的氯仿，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至新的1.5mlep管中，加入-20℃预冷的等体积的异丙醇，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，弃上清，然后用50μl，75％乙醇洗涤沉淀，重复洗涤一次；

(7)将ep管置于通风处晾干后，用5μl去离子水溶解dna样品，置于-20℃冰箱保存；

3、对提取的dna浓度进行测定

将提取的dna样品用ddh2o稀释100倍后，利用紫外分光光度计分别测定od260与od280的吸光值，计算od260/od280测定值，与标准值1.80作比较分析。dna的提取效率＝dna的量(μg)/取样量(100mg)。

结果显示，利用分光光度计测定所提取dna的od260/od280平均值，旗江珧贝壳dna的od260/od280平均值为1.656，栉江珧贝壳dna的od260/od280平均值为1.617，数值均接近标准值1.80，表明提取效率较好。

根据测定dna浓度(μg/μl)的计算公式(od260×稀释倍数×50/1000)，得到所提取旗江珧dna浓度平均值为2.67μg/μl，提取效率为0.1335μg/mg；栉江珧dna浓度平均值为2.61μg/μl，提取效率为0.1321μg/mg。

4、目的基因检测

动物的基因组分为线粒体基因组和核基因组两大部分。以本实验所提取的贝壳dna为模板，分别扩增旗江珧、栉江珧的线粒体基因组所包含的细胞色素氧化酶基因(coi)和核基因组所包含的28srrna、18srrna基因的部分序列，实验所用引物如表1所示。在对目的片段进行pcr扩增后，通过电泳及胶回收获取目的片段，随后，进行测序检验，并将序列在ncbi网站进行序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，以确定dna的来源物种。

表1实验引物序列信息

利用1％凝胶电泳检测总基因组dna的提取效果，如图2显示，泳道1为旗江珧(a.vexillum)总基因组电泳图谱，泳道2为栉江珧(a.pectinata)总基因组电泳图谱，电泳凝胶显示条带整齐，没有弥散，反映出提取的dna具有良好的完整性(此为500mg贝壳提取的总dna，100mg贝壳提取的总dna对于电泳检测来讲，条带太浅，但100mg贝壳提取的总dna数量足够进行pcr检测)。

然后分别利用旗江珧(a.vexillum)和栉江珧(a.pectinata)贝壳中提取的总dna，开展线粒体细胞色素氧化酶coi基因及核基因28s、18srrna基因的验证实验。结果如图3、图4所示，从图中可以看出，线粒体细胞色素氧化酶coi基因(图3，泳道1为旗江珧coi基因的pcr扩增电泳图谱，泳道2为栉江珧coi基因的pcr扩增电泳图谱)以及核基因28s、18srrna基因(图4，泳道1为旗江珧28srrna基因的pcr扩增电泳图谱，泳道2为旗江珧18srrna基因的pcr扩增电泳图谱，泳道3为栉江珧28srrna基因的pcr扩增电泳图谱，泳道4为栉江珧18srrna基因的pcr扩增电泳图谱)电泳条带均较为清晰，符合目的片段大小。

再将电泳条带回收后进行测序，并将测序结果在ncbi数据中进行blast比对分析，其中a.vexillum的同源性大于97％，a.pectinata的同源性大于98％，比对上的第一个物种均分别是a.vexillum和a.pectinata，说明此种方法提取的总dna能够真实的检测出目标基因。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。