基于五羟色胺受体1B分子探针的药物活性成分筛选方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，特别是一种基于五羟色胺受体1b分子探针的药物活性成分筛选方法。

背景技术：

常规的细胞水平、动物水平的药物筛选方法不仅费时、费力，而且容易受到多重因素的干扰，假阳性、假阴性率较高，也很难确定药物作用的靶点，并且需要大量的被筛选化合物。近十年来，随着生物检测技术和计算机技术的快速发展，分子水平的药物筛选方法不断涌现，如：表面等离子体共振法、核磁共振法、下游信号分子检测法、荧光偏振法、虚拟筛选法等等，每种方法有自己的优缺点，都属于间接的筛选方法。本方法具有高灵敏度，低噪音，高通量的特点，不仅能筛选受体激动剂也能筛选拮抗剂/反向激动剂，并且筛选过程不受下游信号的干扰的特点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于五羟色胺受体1b分子探针的药物活性成分筛选方法，根据受体空间构象变化为指针，可以直接、实时监测受体对药物反应的高灵敏度的筛选法。

本发明基于五羟色胺受体1b分子探针的药物活性成分筛选方法包括了以下步骤：

1、构建五羟色胺受体1b分子探针

a、用反向pcr的方法将vsv-gtag序列引入人五羟色胺受体的cdna的5’端，并用in-fusionhdcloningkit（takarabio，us）将青色荧光基团cfp的cdna连接到人五羟色胺受体cdna的3’端第242位氨基酸残基之后，将连接好的五羟色胺受体1b-cfp片段连接到pcdna5/frt/to载体上，从而得到pcdna5/frt/to-vsv-五羟色胺受体1b-ecfp质粒；

b、用in-fusionhdcloningkit在步骤a获得质粒的第三内环第243-299位用flash片段flnccpgccmep取代氨基酸残基，从而得到pcdna5/frt/to-vsv-五羟色胺受体1b-flash-cfp分子探针质粒；

c、将上述构建好的分子探针质粒瞬时转染hek293t细胞48小时，以表达受体分子探针；此受体分子探针为五羟色胺受体1b，其分子内部的第三内环中含有flash基团，c末端连接了cfp荧光基团，两个基团会发生荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，fret）。用阴性对照物生理盐水和阳性对照物受体激动剂cp94253处理瞬时转染细胞，olympus高速荧光显微镜监测fret信号，以fret信号变化指示探针的灵敏度。生理盐水处理五羟色胺受体1b分子探针后，flash基团和cfp基团间的fret信号没有明显变化；受体激动剂cp94253与五羟色胺受体1b分子探针结合后，flash基团和cfp基团间的fret信号随受体的空间构象改变而变化，以fret信号改变来表征五羟色胺受体1b分子结构变化，证明步骤b构建的五羟色胺受体1b分子探针可作为药物筛选的工具，然后进行后续稳定细胞系的建立；

2、建立诱导表达五羟色胺受体1b分子探针的flp-int-rexhek293细胞系

a、将pcdna5/frt/to-vsv-五羟色胺受体1b-flash-cfp分子探针质粒和pog44载体共转染flp-int-rexhek293细胞，并用浓度200μg/ml的潮霉素b筛选阳性细胞克隆；

b、用浓度1μg/ml的盐酸强力霉素诱导阳性细胞克隆表达五羟色胺受体1b分子探针，用荧光显微镜观察分子探针的细胞定位及表达情况，成功诱导表达pcdna5/frt/to-vsv-五羟色胺受体1b-flash-cfp分子探针质粒的稳定细胞株即作为五羟色胺受体1b分子探针细胞进行后续操作；

c、用olympus高速荧光显微镜采集五羟色胺受体1b分子探针细胞的fret信号，阴性对照物生理盐水和阳性对照物受体激动剂cp94253分别处理探针细胞；生理盐水处理时，flash基团和cfp基团间的fret信号没有变化；受体激动剂cp94253处理时，flash基团和cfp基团间的fret信号改变，以fret信号改变来表征五羟色胺受体1b分子探针细胞的结构变化，即表明此五羟色胺受体1b分子探针细胞可作为药物筛选的工具；

3、中药初步分离及检测方法

中药按常规方法进行活性成分的提取分离，用olympus高速荧光显微镜监测中药提取物处理五羟色胺受体1b分子探针细胞时fret信号的波动，生理盐水和受体激动剂cp94253分别作为阴性对照和阳性对照；当中药提取物处理五羟色胺受体1b分子探针细胞后，flash基团和cfp基团间的fret信号没有明显变化，说明提取物没有活性成分作用于五羟色胺受体1b；当中药提取物处理五羟色胺受体1b分子探针细胞后，flash基团和cfp基团间的fret信号改变，表明提取物中可能含有作用于五羟色胺受体1b的活性成分。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明采用基于荧光共振能量转移的方法建立了五羟色胺受体1b分子探针，该分子探针具有高灵敏度，低噪音，高通量的特点，不仅能筛选受体激动剂也能筛选拮抗剂/反向激动剂，并且筛选过程不受下游信号的干扰；

2、经过合理设计的分子探针能够对中药混合物进行筛选，能一步到位的在受体水平上筛选到分子作用靶点明确的先导化合物。

附图说明

图1为本发明分子探针的结构示意图；

图2为本发明实施例3中生理盐水处理结果示意图；

图3为本发明实施例3中阳性药物处理结果示意图；

图4为本发明实施例3中乙酸乙酯相提取物结果示意图；

图5为本发明实施例3中水相提取物结果示意图；

图6为本发明实施例3中石油醚相提取物结果示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。

实施例1：构建五羟色胺受体1b分子探针

a、用反向pcr的方法将vsv-gtag序列引入人五羟色胺受体的cdna的5’端，并用in-fusionhdcloningkit试剂盒（takarabio，us）将青色荧光基团cfp的cdna连接到人五羟色胺受体cdna的3’端第242位氨基酸残基之后，将连接好的五羟色胺受体1b-cfp片段连接到pcdna5/frt/to载体上，从而得到pcdna5/frt/to-vsv-五羟色胺受体1b-ecfp质粒，方法如下：

根据in-fusionhdcloningkit原理，设计引物扩增5ht1br（插入基因）、5ht1br-vline（载体），具体如下表所示：

表15ht1br、5ht1b-vline片段扩增引物序列

采用如下表2所示的混合反应组扩增插入5ht1br片段。

表2pcr合成反应混合液组分

扩增5ht1br的pcr反应条件如下：

；

b、用in-fusionhdcloningkit在步骤a获得质粒的第三内环第243-299位用flash片段flnccpgccmep取代氨基酸残基，从而得到pcdna5/frt/to-vsv-五羟色胺受体1b-flash-cfp分子探针质粒，具体方法如下：

①采用如下表3所示的混合反应组扩增插入flash片段

表3pcr合成反应混合液组分

反应体系如下：

；

pcr反应结束后，将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测pcr产物是否为所需要的扩增的目的片段；具体方法如下：

（1）在电子天平上称量0.3g琼脂糖，放置于200ml规格的三角瓶中；

（2）取30ml1×tae缓冲液于三角瓶中，盖上帽子，轻轻摇晃三角瓶，使琼脂糖混合均匀；

（3）将三角瓶放置于微波炉中，高火加热1min，拿出三角瓶轻轻摇晃一下，再将瓶放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解；

（4）加热完毕后，将三角瓶放置室温冷却至50℃左右，打开塞子滴入1.5μl核酸染料溶液，摇动三角瓶使其混合均匀；

（5）将琼脂糖溶液倒入预先架好的插上梳子的电泳槽的托板中，冷却至室温；

（6）等琼脂糖溶液凝固成胶后，拔掉梳子，将托板放在电泳槽中，添加1×tae缓冲液，保证电泳液1×tae缓冲液没过胶孔；

（7）取出pcr反应结束后的pcr管，用移液枪吸取10μl6xloadingbuffer置于pcr管中，混匀；

（8）用移液枪吸取pcr管中的混合液，轻轻地吹打入琼脂糖凝胶的上样孔中；

（9）最后取5μl合适标准大小的dnamarker，上样于与质粒相邻的泳道中，插上电泳槽的电源，打开开关，电压140v，电泳约40min（线性化载体电泳约50min）；

（10）电泳完毕后，关闭电源；轻轻地取出琼脂糖凝胶，放置于紫外凝胶成像系统中，观察电泳条带的位置并切胶。

②胶回收

pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳后，根据所扩增的分子量的大小进行切胶回收，胶回收使用promega试剂盒，再将胶回收产物跑琼脂糖凝胶电泳检测纯度；

（1）根据分子量的大小切下凝胶中对应位置的胶，放入干净的ep管中，称重。

（2）向放有凝胶的ep管中加入适量试剂盒中的2×bingdingbuffer（一般0.3g加入300μl的2×bingdingbuffer），放在65℃水浴中加热7-10min，至胶完全溶解；

（3）将吸附柱放入2ml离心管中，并编号。将冷却至室温的胶溶液加入吸附柱中（700μl），10000g，离心1min，弃废液。将剩余的胶溶液到离心柱中，按同样条件离心，弃废液；

（4）向吸附柱中加入300μl2×bingdingbuffer，10000g，离心1min，弃废液；

（5）向吸附柱中加入700μlspw（已加入乙醇的），10000g，离心1min，弃废液；重复（5）步骤一次；

（6）将带有吸附柱的离心管空转离心，12000rpm，2min；

（7）取出吸附柱，放入干净的ep管中（编号），静置10min；

（8）将预热到65℃的灭菌水30μl，加到离心柱中心，溶解静置3min；

（9）12000rpm，离心2min，收集dna溶液；

（10）进行琼脂糖凝胶电泳。

③in-fusionhdcloningkit连接反应

根据in-fusionhdcloningkit连接反应体系，将胶回收的插入的目的基因：线性化载体=10:1的浓度最佳比按表格连接反应体系进行连接反应，水浴锅50℃，15min；

表4连接反应混合组分

；

④转化(e.colidh5α感受态细胞)

连接反应结束后，利用e.coli感受态细菌进行转化实验，具体操作如下：

（1）用无菌枪头吸取5μl全部连接产物，加到50μl感受态细胞中。轻轻敲打ep管底，使内含物混合均匀，冰浴30min；

（2）将ep管放入42℃循环水浴中，准确热激90s；

（3）快速将ep管转移到冰中，冰浴5min；

（4）向ep管中加入37℃预热的800μl无抗lb液体培养基，37℃，250rpm，摇床上培养45min；

（5）将菌液6000rpm，离心3min，弃去上清，留100μl-200μl上清，将菌体打散，混匀；

（6）取适量混匀菌液涂布于含有amp的lb固体培养基的培养皿中，室温下正置30min；

（7）倒置平皿于37℃培养箱中过夜培养，12-16h，出现菌落，为待测克隆。

⑤抽提质粒

分别挑取上述步骤④中pcdna5/frt/to-vsv-glur5-5ht1br-cfp和pcdna5/frt/to-vsv-glur5-5ht1br-flash-cfp各10个克隆，接种到6ml含amp的lb液体培养基中，过夜摇菌（14-16h），保存菌液，并抽提质粒。

（1）柱平衡：向吸附柱cp4中（吸附柱要放入收集管中）加入500μl的平衡液bl，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；

（2）取5ml过夜培养的菌液，加入2ml离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；

（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入500μlbufferp1（检查是否加入rnasea），使用涡旋振荡器重悬菌体；

（4）向离心管中加入500μlbufferp2，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解（不要剧烈震荡，所用时间不超过5min）；

（5）向离心管中加入500μlbufferp4，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀。此时出现白色絮状沉淀，然后室温放置10min，12000rpm(~13,400×g)离心10分钟，（可重复5步骤）；

（6）将上一步收集的上清液用移液枪分次加入到过滤柱cs中（过滤柱放入收集管），12000rpm，离心2min，将滤液收集到干净的2mlep管中；

（7）向滤液中加入0.3倍体积的异丙醇（异丙醇过多容易导致rna污染），上下颠倒混匀后转移到吸附柱cp4中，室温12000rpm，离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；

（8）向吸附柱cp4中加入500μl去蛋白液pd，12000rpm离心1min，弃废液；

（9）向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心1min，弃废液。（加入pw后，静置2-5min，更好的去除杂质），重复步骤（9）；

（10）将吸附柱放回收集管中，12000rpm，空转2min。为了将吸附柱中残余的漂洗液去除；

（11）将吸附柱cp4盖子打开，置于室温放置10分钟；

（12）将吸附柱cp4置于干净的离心管中，向内滴加100-300μl洗脱,缓冲液tb，室温静置2分钟，12000rpm，离心1分钟，收集dna溶液；

（13）将收集的质粒dna溶液进行琼脂糖凝胶电泳；

⑥比对序列

将上述步骤⑤中抽提的阳性克隆的质粒dna送基因公司进行测序，进一步准确检测所构建质粒的正确性。主要检测的序列为插入的目的基因5ht1br以及插入的flash序列。

c、将上述构建好的分子探针质粒瞬时转染hek293t细胞48小时，以表达受体分子探针。此受体分子探针为五羟色胺受体1b，其分子内部的第三内环中含有flash基团，c末端连接了cfp荧光基团，两个基团会发生荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，fret）。用阴性对照物生理盐水和阳性对照物受体激动剂cp94253处理瞬时转染细胞，olympus高速荧光显微镜监测fret信号，以fret信号变化指示探针的灵敏度。生理盐水处理五羟色胺受体1b分子探针后，flash基团和cfp基团间的fret信号没有明显变化；受体激动剂cp94253与五羟色胺受体1b分子探针结合后，flash基团和cfp基团间的fret信号随受体的空间构象改变而变化，以fret信号改变来表征五羟色胺受体1b分子结构变化，证明上述（步骤b中所述）构建的五羟色胺受体1b分子探针可作为药物筛选的工具，然后进行后续稳定细胞系的建立；方法实施如下：

（1）第一天下午将hek293t细胞铺12孔板（培养板预先用d-polylysinecoated），到次日早转染时细胞密度约为60-70%；

（2）第2天上午用lipo2000转染细胞

pcdna5/frt/to-vsv-五羟色胺受体1b-flash-cfp分子探针质粒0.6μg融入75μlopti-mem，lipo20001.2μl也融入75μlopti-mem（每孔的量），两者混合均匀后，超净台静置20分钟；混合物静置期间可将12孔板中的旧细胞培养液换成opti-mem0.45ml/孔。轻轻将质粒+转染试剂混合物（每孔150μl）加到12孔板的细胞培养基内，混合均匀，放置于37度培养6h，随后将细胞培养液换成正常培养基（0.75ml/孔），继续培养24小时；

（3）第3天下午，利用高速荧光荧光显微镜检测荧光表达情况，用市售的受体激动剂cp94253激活探针，用olympus高速荧光显微镜监测探针的灵敏度。

实施例2：建立诱导表达五羟色胺受体1b分子探针的flp-int-rexhek293细胞系

1、将pcdna5/frt/to-vsv-五羟色胺受体1b-flash-cfp分子探针质粒和pog44载体共转染flp-int-rexhek293细胞，并用浓度200μg/ml的hygromycinb（潮霉素）筛选阳性细胞克隆，转染中质粒dna：pog44=1：9，总量为3μg；方法实施如下：

（1）第一天，将质粒dna（0.3μg）与pog44（2.7μg）混合物融入500μlopti-mem培养基中（每小瓶的量），脂质体lipo20006μl也融入500μlopti-mem培养基中，将二者混合均匀后，超净台超净台静置20分钟；

（2）混合物静置期间，吸出25cm²的培养瓶中flp-int-rexhek293细胞培养液，1×pbs1ml漂洗三次，向每个培养瓶中加入2.5mlopti-mem培养基，放回37℃，5%的co2培养箱中继续培养；

（3）20min结束后，轻轻将质粒与转染试剂混合物1ml加到25cm²的flp-int-rexhek293细胞培养瓶中，摇晃混合均匀后，将培养瓶放置于37度培养6h，随后将细胞opti-mem培养液换成正常培养基4ml，继续培养；

（4）第二天，将转染过质粒的25cm²培养瓶中的flp-int-rexhek293细胞，传代到150cm²培养瓶中继续培养。

（5）第三天，将150cm²培养瓶中的flp-int-rexhek293细胞培养液换成含200μg/mlhygromycin筛选培养基，继续培养；

（6）每3-4天换液（筛选培养基），直至有单克隆细胞簇出现；

（7）将单克隆细胞簇消化下来，转移至六孔板中继续培养；

（8）将六孔板中的flp-int-rexhek293细胞培养液换成较低浓度hygromycin的维持培养基，进行扩大培养；即初步完成诱导表达pcdna5/frt/to-vsv-glur5-5ht1br-flash-cfp稳定细胞系的构建。

b、用浓度1μg/ml的盐酸强力霉素诱导阳性细胞克隆表达五羟色胺受体1b分子探针，用荧光显微镜观察分子探针的细胞定位及表达情况，检测到成功诱导表达pcdna5/frt/to-vsv-五羟色胺受体1b-flash-cfp分子探针质粒的稳定细胞株内荧光表达正常，即该稳定细胞株即作为五羟色胺受体1b分子探针细胞进行后续操作；

c、用olympus高速荧光显微镜采集五羟色胺受体1b分子探针细胞的fret信号，阴性对照物生理盐水和阳性对照物受体激动剂cp94253分别处理探针细胞；生理盐水处理时，flash基团和cfp基团间的fret信号没有变化；受体激动剂cp94253处理时，flash基团和cfp基团间的fret信号改变，以fret信号改变来表征五羟色胺受体1b分子探针细胞的结构变化，即表明此五羟色胺受体1b分子探针细胞可作为药物筛选的工具；

实施例3：运用本发明五羟色胺受体1b分子探针的细胞检测中药活性成分

本实施例分别以生理盐水、阳性药物cp94253和何首乌植物的提取物成分处理表达五羟色胺受体1b分子探针的细胞，分别研究对五羟色胺受体1b分子探针细胞的fret信号变化。

以何首乌为例进行中药的初步分离及检测方法：何首乌中药用75%丙酮水提取三次，将其提取液再进行石油醚萃取三次，得到石油醚相、乙酸乙酯相、水相。提取分离的各相组分以10ng/ml的浓度处理五羟色胺受体1b分子探针细胞（石油醚相和乙酸乙酯相的提取物可用0.1%dmso助溶），用olympus高速荧光显微镜采集五羟色胺受体1b分子探针细胞的fret信号的波动，用阴性对照物生理盐水和阳性药物受体激动剂cp94253作为对照，实验结果如下；

实验结果：如图2-6所示，将五羟色胺受体1b分子探针细胞置于olympus高速荧光显微镜下，分别用生理盐水、阳性药物cp94253和何首乌石油醚相、乙酸乙酯相、水相提取物处理细胞，监测五羟色胺受体1b分子探针细胞fret信号变化；实验证明五羟色胺受体1b分子探针细胞对生理盐水并无明显反应，何首乌的乙酸乙酯相、水相提取物与五羟色胺受体1b分子探针细胞结合后，也无明显反应化，说明该提取物中的乙酸乙酯相、水相没有活性成分作用于五羟色胺受体1b分子探针细胞。而阳性药物cp94253发生高灵敏度的反应，何首乌石油醚相提取物也有与阳性药物cp94253相似的反应，可以初步证明何首乌石油醚相提取物中可能含有作用于五羟色胺受体1b的活性成分；当阳性药物cp94253作用于五羟色胺受体1b分子探针细胞时（第15s开始），fret信号值降低（第15s至30s），当撤去药物（31s后）fret信号值恢复，说明激动剂cp94253与五羟色胺受体1b分子探针细胞结合使探针的两个荧光基团空间距离变大，降低了能量转移。当何首乌石油醚相提取物作用于五羟色胺受体1b分子探针细胞时（第15s开始），fret信号值降低（第15s至30s），当撤去药物（31s后）fret信号值得到恢复，说明何首乌石油醚相提取物中的成分与五羟色胺受体1b分子探针的结合使探针的两个荧光基团空间距离增大，降低了能量转移；可以用此方法进一步对中药提取物进行检测。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。