MACC1‑AS1探针在制备用于预测胃癌临床预后的诊断试剂中的应用的制作方法

本发明属于基因和rna的功能与应用领域，涉及macc1-as1的应用，特别是涉及macc1-as1探针在制备用于预测胃癌临床预后的诊断试剂中的应用。

背景技术：

胃癌是全球范围内死亡率第二的恶性肿瘤，在中国胃癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤排名前三位。并且由于胃癌早期症状不明显，超过2/3的胃癌病人在初诊时已是晚期。目前针对胃癌化疗的药物种类繁多，例如：烷化剂、抗代谢药及拓扑异构酶抑制剂等。但晚期胃癌的传统化疗方案治疗总反应率(overallresponserate,orr)仅≥40％，中位生存期8-10个月，即便联合靶向治疗，中位生存期仅延长至13.8个月。同时，胃癌化疗疗效异质性较高，尽管部分肿瘤标志物可反应胃癌肿瘤负荷及治疗疗效，但目前仍有待发现预测胃癌患者临床预后的指标及其检测方法。所以，寻找简便的早期诊断及预后方法，挖掘新的抗胃癌药物仍是目前攻克胃癌亟待解决的问题。

能量代谢重组是恶性肿瘤细胞区别于正常细胞的10大特征之一。在正常细胞中，葡萄糖是最重要的供能物质，糖的有氧氧化是最主要的供能途径。而在许多恶性肿瘤细胞中，有氧糖酵解(warburg效应)所产生的atp甚至高达60％，其糖酵解水平是正常细胞的20-30倍。由于恶性肿瘤细胞有无限增殖的特征，肿瘤局部相对缺氧的环境促使肿瘤细胞发生代谢重组以应对能量缺乏的应激状态。ampk(amp-activatedproteinkinase)是细胞内重要的能量感受器，当细胞内amp/atp比例升高时可激活ampk，促使细胞启动合成atp的分解代谢过程，如糖酵解，也可调控磷酸戊糖途径从而产生nadph以平衡氧化还原状态。已有文献报导，在葡萄糖剥夺条件下，ampk可通过macc1(metastasis-associatedincoloncancer-1)调控胃癌细胞通过糖酵解途径获能，这进一步提示代谢相关指标可能可以作为临床胃癌患者评估预后的指标之一。

macc1-as1(nr_046756)是位于macc1反义链的长链非编码rna(longnoncodingrna,lncrna)，尚未见此lncrna在恶性肿瘤中相关功能研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供macc1-as1探针的新应用，具体是macc1-as1探针在制备用于预测胃癌临床预后的诊断试剂中的应用。

优选地，所述macc1-as1探针包括如seqidno:1所示的核苷酸序列。

优选地，所述macc1-as1探针为macc1-as1双地高辛标记核酸探针。

根据本发明所述的应用的进一步特征，所述应用包括通过原位杂交检测来自受试样本中的macc1-as1染色评分，所述macc1-as1染色评分与胃癌患者临床预后及临床分期呈正相关性。

在本发明中，发明人对124例胃癌患者的石蜡组织标本进行原位杂交实验检测macc1-as1表达量，并且对连续切片行免疫组化染色检测macc1表达量及两者的组织内定位情况。结果显示，macc1-as1在胃癌组织中的表达高于癌旁组织，且临床分期越高，tnm分期越高，macc1-as1表达水平越高。动物试验也提示，macc1-as1能促进胃癌细胞肺部转移。在功能学实验中，验证macc1-as1在葡萄糖剥脱或葡萄糖低浓度时对胃癌细胞抵抗凋亡，维持增殖的促进作用。以上两部分实验可证明macc1-as1的杂交探针作为胃癌患者临床预后检测试剂的重大价值。在分子机制水平，检测了无糖或低糖、氧化应激处理后胃癌细胞株内macc1-as1表达量改变，检测了如上处理联合过表达macc1-as1后胃癌细胞糖酵解相关酶的表达改变及活性改变、细胞内还原性物质(nadph、gsh)含量改变及细胞产生atp的量的变化。在胃癌细胞实验中，无糖或低糖刺激后细胞内macc1-as1表达明显增加，同时予抗氧化剂处理可见macc1-as1无明显变化。过表达macc1-as1处理后的胃癌细胞在无糖或低糖环境下可维持增殖能力、凋亡减少。上述分子学实验可以证明macc1-as1在胃癌细胞行糖酵解途径产能过程中发挥的重要作用，是帮助胃癌细胞处于葡萄糖相对缺乏、氧化应激条件下维持生存的重要分子。因此可以认为，macc1-as1可能是调控应激条件下细胞发生代谢重组的关键分子。因此，本发明为研究判断胃癌患者预后的检测探针提供了理论依据和临床基础，从而证明macc1-as1探针可以预测胃癌患者预后的机制。

本发明的另一个目的是提供一种用于预测胃癌临床预后的诊断试剂盒，该试剂盒包括macc1-as1探针。根据本发明所述的诊断试剂盒的进一步特征，所述诊断试剂盒为原位杂交检测试剂盒。

所述诊断试剂盒根据原位杂交试剂盒的标准步骤进行。试剂盒内主要成分为macc1-as1探针，常规成分为：40％去离子甲酰胺、10％葡聚糖、1×denhardt's、0.02％ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)。染色深度共分为0分(无色)、1分(淡紫色(原位杂交染色))、2分(紫色)、3分(深紫色)，每种染色所占面积则依照0分(无细胞染色)、1分(25％染色)、2分(50％染色)、3分(75％染色)及4分(100％染色)。然后染色深度评分和对应的染色面积评分相乘后相加，既得到了最后的macc1-as1染色评分。其中0-2分定义为阴性表达，3-7分定义为弱阳性表达，8-12分定义为强阳性表达。通过计算macc1-as1染色评分，可见诊断胃癌tnm分期的灵敏度为：52.63％，特异度为：63.53％，且评分越高的患者预后越差。

本发明首次揭示了macc1-as1与临床胃癌患者预后相关，与患者tnm分期及临床分期相关。动物试验也提示，macc1-as1能促进胃癌细胞肺部转移，同时也首次验证了macc1-as1在胃癌细胞糖酵解过程中的重要功能，揭示了macc1-as1具有胃癌预后价值的机制。

附图说明

图1a是通过原位杂交技术检测macc1-as1在胃癌组织与癌旁组织表达量差异的结果统计图。

图1b是通过原位杂交技术检测不同临床分期患者癌组织与癌旁组织切片内macc1-as1表达及分布情况代表图，放大倍数：400。

图1c是在不同tnm组别中macc1-as1表达情况统计结果图。

图1d是在连续切片行免疫组化染色或原位杂交后，macc1与macc1-as1组织内分布代表图。

图1e是连续切片内macc1与macc1-as1共表达情况统计结果图，放大倍数：400、1000。

图1f-h是macc1-as1的不同表达水平对i-iii期胃癌患者预后的影响的kaplan-meier曲线图。

图1i-k是iv期胃癌病人的预后分析的kaplan-meier曲线图，依照macc1-as与macc1是否共表达进行分组。

图1l显示表1-1：macc1-as1和macc1的表达与胃癌患者分期和预后的关系。

图1m显示表1-2：tnmi-iii期和iv期的临床病例资料与macc1-as1的表达。

图2a-b是裸鼠尾静脉注射过表达macc1-as1的胃癌细胞株后肺部转移灶

的大体代表图及免疫组化代表图。

图3a是macc1-as1结构示意图。

图3b是正常胃上皮细胞及各胃癌细胞株中macc1-as1表达量的pcr结果统计图。(#p<0.01)

图3c是荧光原位杂交及荧光免疫染色结果图，分别显示macc1-as1及macc1的细胞内定位。放大倍数：3000。

图3d是pcr技术检测胃癌细胞中macc1-as1表达的核质分布情况。

图4a-b是予无糖刺激、n-乙酰半胱氨酸处理胃癌细胞后ros(reactiveoxygenspecies)检测结果(+p<0.001)。

图4c-e是使用无糖培基(c)、h2o2(d，ros诱导剂)、2-dg(e，2-deoxy-d-glucose，糖酵解抑制剂)处理胃癌细胞后pcr检测macc1-as1表达量变化的统计结果图。(*p<0.05，#p<0.01，+p<0.001)

图4f是予无糖刺激、n-乙酰半胱氨酸处理胃癌细胞后pcr检测macc1-as1表达量变化统计结果图。(#p<0.01)

图4g是予低糖培基培养胃癌细胞后pcr检测macc1-as1表达量变化统计结果图。(#p<0.01，+p<0.001)

图4h是予低糖培基培养胃癌细胞后westernblot检测糖酵解相关蛋白表达水平改变。

图5a是瞬时转染质粒构建的过表达macc1-as1的胃癌细胞株的pcr验证结果图。(+p<0.001)

图5b是mtt实验检测糖剥夺条件下过表达macc1-as1细胞株的存活情况的结果统计图。(+p<0.001)

图5c是在不同浓度的低糖培基培养下的过表达macc1-as1胃癌细胞株克隆形成实验的结果图。

图5d是过表达macc1-as1细胞株多个凋亡相关蛋白westernblot代表图。

图5e-f是无糖刺激后过表达macc1-as1胃癌细胞株行流式检测细胞周期的结果图。

图5g-h是edu(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)实验检测无糖应激时过表达macc1-as1胃癌细胞株增殖能力结果图。(*p<0.05)

图5i-j是流式检测无糖应激时过表达macc1-as1胃癌细胞株凋亡情况结果图。(*p<0.05)

图6a是pcr实验证明过表达macc1-as1胃癌细胞株内糖酵解相关基因mrna表达情况结果统计图。(*p<0.05)

图6b-c显示过表达macc1-as1胃癌细胞株内糖酵解相关蛋白表达情况，为westernblot(b)及免疫荧光染色(c)结果图。放大倍数：1200。

图6d-e是无糖刺激下过表达macc1-as1胃癌细胞株2-nbdg(2-[n-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-d-glucose，葡萄糖类似物)摄取量流式检测结果图。(*p<0.05)

图6f-g是无糖或低糖处理后检测过表达macc1-as1胃癌细胞株的atp(f)及乳酸(g)含量变化统计结果图。(*p<0.05，+p<0.001)

图6h-i是过表达macc1-as1胃癌细胞株内己糖激酶活性(h)及乳酸脱氢酶活性(i)检测结果统计图。(*p<0.05)

图7a是细胞内糖酵解和磷酸戊糖途径代谢示意图。

图7b是无糖刺激下过表达macc1-as1胃癌细胞株ros的检测结果定量图。(+p<0.001)

图7c-e是使用无糖培基(c)、h2o2(d，ros诱导剂)、2-dg(e，2-deoxy-d-glucose，糖酵解抑制剂)分别处理过表达macc1-as1胃癌细胞株后检测细胞生长抑制率统计结果图。其中加入n-乙酰半胱氨酸处理组为阳性对照组。(*p<0.05，#p<0.01，+p<0.001)

图7f-g是无糖刺激下过表达macc1-as1胃癌细胞株nadph(f)、nadp+/nadph(g)检测结果统计图。(*p<0.05，#p<0.01，+p<0.001)

图7h-i是无糖刺激下过表达macc1-as1胃癌细胞株gsh(g)、gssg/gsh(h)检测结果统计图。(#p<0.01)

具体实施方式

患者及肿瘤组织标本

本发明所涉及的所有实验是在南方医科大学南方医院伦理委员会的许可下进行的，所有的肿瘤组织标本取材都经过了患者同意。石蜡包埋标本是源于124例胃癌患者手术标本，取材时间从2004年至2010年。所有纳入的患者均依照ajcc2010标准进行了分级。

免疫组化及原位杂交染色

免疫组化的具体步骤及染色评分系统可参照发明人所在团队此前所发表的文章(wang,l.,etal.,metastasis‐associatedincoloncancer-1upregulationpredictsapoorprognosisofgastriccancer,andpromotestumorcellproliferationandinvasion.internationaljournalofcancer,2013.133(6):p.1419-1430.)。原位杂交染色采用原位杂交试剂盒的标准步骤进行。免疫组化染色标识了macc1蛋白，原位杂交标识了macc1-as1。原位杂交试剂盒的主要成分为macc1-as1探针，是双地高辛标记核酸探针，具体核酸序列为：5’dign/tcaatgcagatctaatactcct/3’dig_n(seqidno:1)。常规成分为：杂交缓冲液：40％去离子甲酰胺、10％葡聚糖、1×denhardt's、0.02％ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)。免疫组化染色所使用macc1抗体购自abcam公司(sanfrancisco，加州，美国)，hrp标记二抗购自中杉金桥公司，dab染色试剂盒购自cwbio公司。

原位杂交染色步骤：首先按照原位杂交试剂盒说明书进行试剂配制。用切片机将石蜡包埋好的组织制成约4μm厚度的组织切片，60℃烤片1小时，二甲苯脱蜡(二甲苯脱蜡10min×3次，100％乙醇3min×2次，95％乙醇3min，置于pbs中清洗×2次)，将切片甩干，于组织处滴加300μl的蛋白酶k溶液，完全覆盖组织切片，于37℃催化10分钟，将玻片置于pbs中终止，切片脱水(70％乙醇1分钟，95％乙醇1分钟，100％乙醇1分钟)，将切片平坦放置，滴加25μl配制好的杂交混合液(探针浓度80nm)，置于恒温箱50℃2小时。ssc缓冲液清洗切片(5×ssc5分×1次，1×ssc5分×2次，0.2×ssc5分×3次)，封闭液孵育15分钟，滴加anti-dig(1:800)试剂反应60分钟，pbst清洗×3次，每次3分钟，滴加ap底物nbt/bcip，30℃避光2小时，ktbt缓冲液孵育，终止反应。0.2％核固红复染2分钟，水冲洗10分钟，切片脱水(70％乙醇5分×2次，95％乙醇5分×2次，100％乙醇5分×2次)，滴加封片剂盖盖玻片封片，使用正置光学显微镜进行观察拍片及染色评分。

染色深度共分为0分(无色)、1分(淡黄色(免疫组化染色)、淡紫色(原位杂交染色))、2分(黄色、紫色)、3分(棕黄色、深紫色)，每种染色所占面积则依照0分(无细胞染色)、1分(25％染色)、2分(50％染色)、3分(75％染色)及4分(100％染色)。然后染色深度评分和对应的染色面积评分相乘后相加，既得到了最后的macc1染色评分。其中0-2分定义为阴性表达，3-7分定义为弱阳性表达，8-12分定义为强阳性表达。

细胞培养：人类胃癌细胞系bgc803、bgc823、mkn45、sgc7901,mgc803及正常胃黏膜上皮细胞系ges-1购自foleibao(上海，中国)。细胞培基是rpmi1640培基，其中加入10％胎牛血清，均购自hyclone(犹他州，美国)。培养条件为37℃，5％co2。构建无糖应激条件时使用无糖培基1640，购自gibco(美国)。

载体构建及瞬时转染：过表达macc1-as1质粒是由invitrogen公司通过pcr扩增macc1-as1cdna，xbai及ecori位点进行亚克隆后构建的。转染使用的媒介是lipofectamine2000试剂盒，购自invitrogen公司，按照试剂盒内说明书操作。

慢病毒转染：macc1-as1过表达慢病毒由genechem公司(上海，中国)构建，以感染复数200转染bgc803及mkn45两株胃癌细胞。经1μg/ml嘌呤霉素筛选2周后，经过pcr验证获得macc1-as1稳定过表达的细胞株。上述步骤也用于构建macc1稳定沉默株胃癌细胞。

动物实验：将过表达macc1-as1胃癌细胞株mkn45以5×10⁵数量经尾静脉注入4周龄裸鼠体内，注射6周后予断颈处死，取出完整肺组织拍照并将其石蜡包埋，行he染色及免疫组化染色。

蛋白质印迹法(westernblot)：细胞总蛋白提取依照了发明人团队此前发表的文章(yang,t.,etal.,macc1mediatesacetylcholine-inducedinvasionandmigrationbyhumangastriccancercells.oncotarget,2016)。

使用抗体：abcam(剑桥，马萨诸塞州，美国)公司：glut1、hk2单克隆抗体；immunoway(纽约，德拉瓦州，美国)公司：gapdh单克隆抗体；proteintechgroup(芝加哥，伊利诺州，美国)公司：ldh、β-actin、组蛋白h3单克隆抗体；abclonal(剑桥，马萨诸塞州，美国)公司：caspase3、bax、cdk1、cdkn单克隆抗体。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗及山羊抗鼠二抗购自bioss(北京，中国)。使用imagej软件进行蛋白水平半定量，β-actin及组蛋白h3是内参。

rna提取及实时定量荧光pcr

细胞内总rna提取是使用trizol试剂(invitrogen公司)，具体操作流程依照产品说明书。cdna合成使用firststrandcdna试剂盒(takara)。荧光定量pcr使用sybrgreendye试剂盒(购自roche，彭茨贝格，德国)完成。实验中所用引物序列如下表所示。相对表达量以snrnau6或β-actin为参照进行2^-δδct运算。

macc1-as1：

f-gccagtcagaaaatgaggaac(21nt)

r-ccagttgggtgaacaggac(19nt)

葡萄糖转运体1(glut1)：

f-ggttgtgccatactcatgacc(21nt)

r-cagataggacatccagggtagc(22nt)

己糖激酶2(hk2)：

f-tcccctgccaccagacta(18nt)

r-tggacttgaatcccttggtc(20nt)

单羧酸转运体1(mct1)：

f-catgccaccaccagcgaag(19nt)

r-tgacaagcagccaccaacaatc(22nt)

6磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pd)：

f-acagagtgagcccttcttcaa(21nt)

r-ggaggctgcatcatcgtact(20nt)

β-肌动蛋白(β-actin)：

f-tggcacccagcacaatgaa(19nt)

r-ctaagtcatagtccgcctagaagca(25nt)

u6：

f-ctcgcttcggcagcaca(17nt)

r-aacgcttcacgaatttgcgt(20nt)

18s-rna：

f-gcccgaagcgtttactttga(20nt)

r-tccattattcctagctgcggtatc(24nt)

荧光原位杂交及免疫荧光染色

合成cy3探针用于荧光原位杂交以显示macc1-as1，待染细胞经pbs清洗后于多聚甲醛(索莱宝公司，中国)浸润下行室温下15分钟固定。多聚甲醛清洗后，将培皿置于冰上，于0.5％tritonx-100中浸润10分钟，增加细胞通透性。pbs再次清洗3遍后，按照锐博公司(广州，中国)的fluorescentinsituhybridization试剂盒说明书行杂交过程，杂交环境为避光潮湿的小室内，37℃12小时。杂交结束后予系列浓度的柠檬酸钠缓冲液(saline-sodiumcitrate，ssc)清洗。为显示macc1-as1与macc1共定位情况，同一皿细胞再次经多聚甲醛固定后，1％triton溶液孵育20min，使用3％bsa溶液封闭30min。macc1一抗稀释比例根据产品说明书调整，一抗4℃孵育过夜。之后，使用荧光二抗(购自beyotime，中国上海)室温孵育1h，予4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，dapi)染细胞核。最终使用共聚焦显微镜(olympusoptical，日本东京)观察拍摄。

细胞核细胞质rna及蛋白分离

细胞于冰上经pbs清洗3遍后，按照paris试剂盒(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)说明书操作。简单来说，细胞经分离缓冲液(cellfractionationbuffer)裂解后，冰上孵育10分钟，4℃500g离心5分钟，离心后取上清即为胞质成分，余下胞核成分内加入细胞破碎缓冲液(celldisruptionbuffer)

继续裂解，获取的胞质部分及胞核部分再按照说明书进行rna及蛋白质提取，获取产物最终经pcr及westernblot验证分离效果。

代谢物、ros及酶活性检测

待测细胞以2×10⁵/孔的密度种于六孔版，转染过表达macc1-as1质粒，48小时后无糖刺激组将培基更换为无糖培基，培养12-24小时，收集细胞培基用于测量乳酸浓度(试剂盒购自南京建成生物工程研究所，中国)，细胞经裂解用于测量atp(试剂盒购自碧云天，海门，中国)、己糖激酶2(hexokinase2，hk2)活性及乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，ldh)活性(试剂盒购自科铭生物技术有限公司，苏州，中国)。ros检测是按照试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，中国)说明书操作，通过荧光2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(fluorescent2’,7’-dichlorofluorescindiacetate，dcf-da)进行检测。

nadp+/nadph及gsh/gssg检测

待测细胞经12小时无糖培基培养后，用胰酶将细胞收集后，按照nadp+/nadph及gsh/gssg定量检测试剂盒(购自biovision公司，加利福尼亚州，美国)内说明书进行操作。

细胞凋亡、存活率及细胞周期检测

细胞凋亡是按照annexin/pi试剂盒(凯基生物技术有限公司,南京,中国)说明书进行操作，通过流式细胞分析仪(bdbiosciences公司,圣何塞,加利福尼亚州,美国)进行检测。细胞周期是按照细胞周期检测试剂盒(凯基生物技术有限公司,南京,中国)说明书进行操作。细胞存活率是通过mtt实验及edu(5-ethynyl-2'-deoxyuridine，5-乙炔基-2-脱氧尿苷)实验(试剂盒购自锐博生物科技有限公司，广州，中国)按照说明书操作进行检测。

克隆形成实验

稳定转染后过表达macc1-as1的胃癌细胞株以1×10³/孔的密度接种于6孔板培养2天，低糖刺激组更换为相应葡萄糖浓度培基进行培养2周。用pbs清洗细胞2次，经多聚甲醛固定后，用0.5％结晶紫溶液染色。清洗干净后拍照记录。

数据分析

所有数据分析均使用graphpadprism软件。t检验及one-wayanova检验用于文中数据组间对比评估是否存在统计学差异。kaplan-meier生存曲线可形象的展示不同分组间生存时间的差异，统计学差异由wilcoxon秩和检验计算得出。cox回归分析用于确定胃癌患者预后独立因素，事件定义为与癌症有关的死亡事件。spearman相关性分析用于计算胃癌患者临床分期及macc1-as1染色评分的关联程度。pearson相关分析用于计算macc1-as1及macc1的决定系数r²。p值小于0.05则认为存在统计学差异。

试剂：2-脱氧-d-葡萄糖(2-deoxy-d-glucose，2-dg)、放线菌酮(cycloheximide，chx)、放线菌素d(dactinomycind)购自medchemexpress公司(普林斯顿，马萨诸塞州，美国)，mtt(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)购自盖云天生物技术有限公司(武汉，中国)。2-nbdg(2-[n-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-d-glucose，葡萄糖类似物)及dapi(4’,6-diamidino-2-phenylindole，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)购自invitrogen公司。h2o2、nac(n-acetyl-l-cysteine，n-乙酰-l-半胱氨酸)购自sigma-aldrich公司(美国)；活体成像荧光素vivogloluciferin购自promega公司(麦迪逊市，威斯康辛州，美国)。pgem—t载体、t4dna连接酶、限制性内切酶sacii、sp6rnapolymerase也购于promega公司；质粒提取试剂盒及dna纯化试剂盒购白tiangen；dig标记crna探针的标记试剂盒，为boehringermannheim公司产品。其他试剂上文已提及。

实施例一：macc1-as1高表达与胃癌患者不良预后相关。

使用原位杂交(ish)对124例胃癌患者的石蜡组织标本进行macc1-as1表达量评估。结果显示，macc1-as1在胃癌组织的表达量显著高于癌旁组织(图1a)。随患者临床分期的增加，macc1-as1染色评分也增加(图1b)。

根据macc1-as1染色深度，所有患者被分成3组，分别是阴性组(0～2分)、弱阳性组(3～7分)、强阳性组(8-12分)。在124例胃癌患者中，总共有8例阴性患者，116例为macc1-as1阳性，其中64例为弱阳性，52例为强阳性。以病理诊断为金标准，可见macc1-as1的双地高辛标记核酸探针诊断胃癌tnm分期的灵敏度为：52.63％，特异度为：63.53％。(计算公式：灵敏度＝iv期高表达人数/iv期总人数×100％；特异度＝i-iii期无表达及低表达人数/i-iii期总人数×100％)

把所有患者分别按t分期、n分期、m分期分组，发现macc1-as1的表达与t分期(p<0.001)、n分期(p<0.001)、m分期(p<0.001)及tnm分期呈正相关(图1c)。通过进行连续切片的macc1免疫组化染色可见，macc1-as1与macc1成共定位表达现象(图1d)，且macc1-as1表达量与macc1正相关(r²＝0.413，p<0.001)(图1e)。kaplan-meier生存分析可见，macc1-as1的高表达在临床分期i-iii期(图1f-h)及iv期患者(图1i-k)的亚组分析中无病生存期及总生存期更短，macc1-as1与macc1共表达患者预后更差。表1-1：macc1-as1和macc1的表达与胃癌患者分期和预后的关系(见图1l)。表1-2：tnmi-iii期和iv期的临床病例资料与macc1-as1的表达(见图1m)。

根据上述的临床观察结果，可以认为macc1-as1在胃癌中与患者不良预后相关。由此证明，临床活检或手术的胃癌标本，按原位杂交试剂盒的标准步骤进行原位杂交染色后，按材料与方法中的标准计算macc1-as1染色评分，评分越高的患者预后越差。

结合macc1-as1基因位置及团队对macc1在糖代谢方面研究结果，考虑macc1-as1可能通过糖代谢影响胃癌细胞生存，继而与患者预后相关。

实施例二：体内实验证实macc1-as1显著促进胃癌细胞肺部转移

将过表达macc1-as1胃癌细胞株mkn45以5×10⁵数量经尾静脉注入4周龄裸鼠体内，注射6周后断颈处死，取出肺部拍照(图2a)并将其石蜡包埋，行he染色及免疫组化染色，检测macc1、ki67(增殖指标)及8-ohdg(氧化应激水平指标)(图2b)，结果可见macc1-as1过表达组相对于空载对照组的肺部转移灶数量及体积较大，macc1及ki67表达较高，8-ohdg表达明显下降，说明macc1-as1促进胃癌细胞肺部转移，促进胃癌细胞增殖，抵抗氧化还原应激。

实施例三：相较于正常胃黏膜上皮细胞，macc1-as1在胃癌细胞中显著高表达。

根据ncbi数据库，确定macc1-as1定位于macc1基因的反义链(图3a)。通过检测正常胃黏膜细胞及多株胃癌细胞株内macc1-as1表达量，可以发现macc1-as1高表达于胃癌细胞中(图3b)。选取其中的bgc803及mkn45两株胃癌细胞株进行后续实验。

由于lncrna在细胞内的定位可以辅助确定其发挥功能的方式，故行荧光原位杂交实验(fish)及核质分离后提取rna行pcr以检测macc1-as1在胃癌细胞内分布情况，可见macc1-as1主要分布于细胞质(图3c-d)。免疫荧光染色也发现，macc1与macc1-as1存在共定位现象，共同定位于胞质(图3c)。

上述实验结果侧面反映了macc1-as1可能参与macc1的转录后水平调控，影响macc1在无糖应激时对细胞的保护作用。

实施例四：在糖剥夺诱发ros生成环境中macc1-as表达增加。

流式结果验证，糖剥夺0h、6h、12hros的水平均明显增加，时间越长ros水平越高，加入抗氧化剂nac后相应时间点ros的水平可回落(图4a-b)。

pcr检测结果显示，在使用无糖培基(图4c)、h2o2(ros诱导剂，图4d)、2-dg(2-deoxy-d-glucose，糖酵解抑制剂，图4e)分别处理胃癌细胞0、8、16、24h后检测macc1-as1的表达量均随着时间而增加。低糖培养条件下，macc1-as1表达亦有所升高(图4g)。为了探索是否为ros促进了macc1-as1水平的增高，予无糖刺激、nac(抗氧化剂)处理胃癌细胞后行pcr检测，发现nac可显著降低无糖刺激下的macc1-as1表达(图4f)。接下来研究，无糖或低糖培养时显著增加的macc1-as1是否与糖代谢相关，于是行westernblot检测蛋白水平上，低糖刺激下糖酵解过程关键酶hk2，glut1表达量增加(图4h)。

综上表明，在糖剥夺诱导ros生成环境中macc1-as表达增加，并且影响糖酵解相关酶表达。

实施例五：macc1-as1可以帮助胃癌细胞抵抗糖剥夺诱发的凋亡

为了明确macc1-as1在胃癌细胞中发挥的功能，构建了macc1-as1过表达质粒，并对bgc803及mkn45两株细胞进行转染(图5a)。mtt实验证明在糖剥夺条件下，过表达组细胞死亡明显少于对照组(图5b)。至于macc1-as1对胃癌细胞株较长时间的影响探究，进行克隆形成实验，同样证明低糖培养条件下，过表达组可形成更多更大的细胞团(图5c)。接下来利用westernblot及流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化情况，发现过表达组凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3及bax表达减少(图5d)，意味着macc1-as1过表达组凋亡减少。流式细胞仪检测同样发现糖剥夺条件下，过表达组s期阻滞较对照组减少(图5e-f)，凋亡减少(图5i-j)。通过edu实验，发现macc1-as1过表达组在糖剥夺情况下生存及增殖情况优于对照组(图5g-h)。细胞功能实验结果提示了macc1-as1在胃癌细胞发生无糖应激时可维持细胞的生存，减少凋亡。

实施例六：macc1-as1通过糖酵解途径促进细胞的存活。

pcr实验发现过表达macc1-as1胃癌细胞中糖酵解相关基因glut1、hk2、g6pd、mct1表达量均升高(图6a)。westernblot(图6b)及免疫荧光染色(图6c)结果示，过表达macc1-as1的mkn45，bgc803细胞中hk2、glut1、ldha表达量均升高。无糖刺激下过表达macc1-as1胃癌细胞株2-nbdg(2-[n-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-d-glucose，葡萄糖类似物)摄取量明显增加，提示macc1-as1可增加细胞葡萄糖摄取能力(图6d-e)。

为了进一步确认macc1-as1与糖酵解过程有关。予无糖或低糖处理后检测过表达macc1-as1胃癌细胞株的atp(图6f)及乳酸(图6g)含量，发现随着葡萄糖浓度降低，atp含量升高，乳酸水平降低，并且过表达macc1-as1组均高于对照组。同时，过表达macc1-as1胃癌细胞内己糖激酶活性(图6h)及乳酸脱氢酶活性(图6i)也均升高。

综上所述，可以认为macc1-as1通过糖酵解途径促进细胞的存活。

实施例七：macc1-as1通过促进糖酵解及产生nadph维持细胞内氧化还原平衡予糖剥夺处理后，流式细胞仪检测细胞内ros产生明显增加，但过表达组ros的增加量较少(图7b)。当分别予无糖刺激(图7c)、h2o2(图7d)及糖酵解抑制剂2-dg(图7e)处理胃癌细胞，均可见细胞生长抑制率增加，而过表达macc1-as1可发挥部分类似nac的作用控制增加的抑制率。

在细胞内清除ros，挽救生长抑制率的其中一个方法便是增加抗氧化物质如nadph及gsh的水平。遂予无糖刺激后检测过表达组与对照组的nadph及gsh可发现：无糖刺激后nadph明显减少(图7f)，nadp+/nadph有所增加(图7g)，但过表达组可明显增加细胞内nadph，平衡nadp+/nadph比例。类似的，macc1-as1过表达组也可增加无糖刺激后细胞内的gsh水平(图7h)，降低gssg/gsh(图7i)，以抵抗无糖导致细胞内积聚的ros的细胞毒性。

综上结果提示，胃癌细胞发生无糖应激时，macc1-as1通过产生抗氧化物质减轻ros对细胞的毒性，可能是macc1-as1促进胃癌细胞发生糖酵解的途径之一。综合实施例五至七，证明macc1-as1是帮助胃癌细胞应对无糖应激的重要分子，主要途径是通过产生抗氧化物维持氧化还原平衡及促进糖酵解过程。因此证明了macc1-as1探针作为胃癌预后检测方法的理论依据及机制。

综上所述，本发明首次明确macc1-as1作为胃癌患者临床预后指标的重要意义，macc1-as1高表达预示了胃癌患者较差的预后，通过原位杂交染色并计算macc1-as1染色评分，评分越高的患者预后越差。体内实验证实了macc1-as1对胃癌细胞肺部转移的促进作用。在后面的细胞功能学实验及分子机制实验中，证明了在无糖或低糖应激情况下，macc1-as1是通过增加胃癌细胞内还原性物质如nadph、gsh以抵抗ros的细胞毒性，进一步发挥促进细胞糖酵解代谢以维持能量供给的作用，来维持胃癌细胞的生存及增殖，减少凋亡。综上证明了macc1-as1与胃癌预后相关的机制。

本发明首先证明macc1-as1与胃癌患者临床预后及临床分期的正相关性及其对胃癌患者不良预后的预测意义，从而首次使用macc1-as1的双地高辛标记核酸探针，对胃癌组织及癌旁组织行原位杂交染色。按材料与方法中的标准计算macc1-as1染色评分，可见诊断胃癌tnm分期的灵敏度为52.63％，特异度为63.53％，且评分越高的患者预后越差。其次，发现在胃癌细胞经历无糖应激时macc1-as1表达增加，进而发现它可通过增加细胞内nadph、gsh含量抵抗氧化应激，促进糖酵解途径供能，减少胃癌细胞凋亡。因此可推断，在胃癌细胞中，macc1-as1是维护正常糖代谢的重要分子，并证明了它作为胃癌预后标志的原因。

序列表

<110>南方医科大学南方医院

<120>macc1-as1探针在制备用于预测胃癌临床预后的诊断试剂中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

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