大豆内生菌及其应用的制作方法

本申请为申请号201510162612.5、申请日为2015年04月08日、发明名称为《大豆内生菌及其应用》的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及微生物技术领域。

背景技术：

大豆是一年生草本豆科植物，其种子也称为大豆，是世界上最重要的豆类。大豆不单指黄豆，它还包含黑豆和青豆。黄豆是重要的油料、食用和饲料作物，黄豆中的蛋白质能提供赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸等许多人体必需氨基酸。此外，黄豆中还含有大量不饱和脂肪酸、磷脂、纤维素、维生素以及丰富的钙、磷、镁、钾等无机盐和铜、铁、锌、碘、钼等微量元素。黄豆具有抗氧化、抗衰老、抗癌、防止血管硬化、促进骨骼发育和降糖等多种功能。黑豆为大豆的黑色种子，可药食两用，与黄豆最大的不同是黑色外皮含有大量类黄酮化合物花色素类色素。此外，黑豆含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、尼克酸、胡萝卜素、微量元素和粗纤维，其中蛋白质含量达48％以上，居豆类之首，高于肉类、鸡蛋和牛奶，素有“植物蛋白之王”的美誉。黑豆具有软化血管、滋润皮肤、延缓衰老等功效。

大豆中除了含有以上提到的各种“非生物”类营养物质外，像其他植物一样还含有各种内生菌。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物，以真菌和细菌为主。目前从黄豆、豌豆、菜豆、矮四季豆和苜蓿等豆科植物不同组织器官中分离内生菌已有报道，但尚未见从黑豆中分离内生菌的报道。以往人们从豆科植物中分离内生菌的主要目的是将所分离的有益菌株应用于农业领域。如植物内生菌可增加植物株高和干重、增强植株生长势、提高种子发芽率和幼苗存活率、增加植物分蘖生长和花序形成等。植物内生菌可以通过生物固氮和产生促进植物生长的生长素、赤霉素以及细胞分裂素等，直接促进植物生长；内生菌还可以通过诱导寄主植物产生植物激素，通过增强植物对n、p等营养元素以及其他矿物质的吸收来促进植物生长(周怡等，大豆科学，2009，28(3):502-506)。此外，以往报道的植物内生菌还具有增强宿主抗逆性和抗病虫害能力。植物抗逆性的增强作用主要表现在生物胁迫(如抵抗病虫害侵袭，阻抑昆虫和食草动物的采食等)和非生物胁迫(如抗高温、抗干旱、抗冷害、抗盐碱等)两方面，主要机制是内生菌通过影响宿主植物物质代谢并产生生理活性物质来改变植株的生理特性，提高植物的抗逆性，刺激植物生长；植物内生菌可以与病原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌生长；或通过诱导植物产生酚类、醌类物质在细胞间隙积累，从而构成病原菌进入植物体内或在植物体内运转的化学屏障。

依照国际通行的判定标准，判断一个城市或国家是否进入“老龄化社会”的标志是60岁以上的人口所占比重是否已经达到或超过总人口数的10％。最新数据显示，中国现有的老龄人口已超过1.6亿而且每年在以近800万的速度增加。当前我国已经进入老龄化社会，老年人口逐年在迅速增加，随之而来的是冠心病、糖尿病、骨质疏松、神经退行性疾病等老年性疾病明显增多，给国家的经济、文化和医疗等带来了巨大压力和挑战。这些老年性疾病虽由多因素引起和多基因参与，而机体衰老则是共同因素。衰老是一个机体不可避免的生理过程，是人类有史以来一直研究而未能够解决的重大问题，因此，有目的寻找延缓衰老方法，以有效降低因机体衰老而引发的老年性疾病，是当前亟待解决的重大问题。

秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)属线形动物门，自然状态下，秀丽隐杆线虫是一种生活在土壤中的以细菌和腐殖质为食，能够感知气味、光线、温度的通身透明生物，也是唯一一个身体中所有细胞能被依次盘点并各归其类的生物。秀丽隐杆线虫生活史短，在20℃下的平均生活史为3.5天左右，整个生命周期约为3周左右。秀丽隐杆线虫是一种具有多细胞的真核生物，它也要经历复杂的细胞分裂和增殖过程才能最终形成与高等生物相似较复杂的组织和器官系统，如皮肤、肌肉、消化、神经、生殖等，这使得秀丽隐杆线虫具有与高等生物体相似的一些细胞、分子结构及寿命控制通路。因此，通过秀丽隐杆线虫这种模式生物所获得的生物学知识可以直接应用于高等生物甚至包括人类(barbierietal.americanjournalofphysiologyandendocrinologymetabolism，2003，285:e1064-1071)。shtonda和avery在研究秀丽隐杆线虫饮食行为时发现，线虫具有自行判断周围环境中的细菌是否有毒并对所食用的细菌进行选择的能力(journalofexperimentalbiology，2006，209:89-102)。此外，有研究证实，当以人体致病菌屎肠球菌(sifrietal.，infectiousimmunology，2002，70:5647-5650)和金黄色葡萄球菌(sifrietal.，infectiousimmunology，2006,74:1091-1096)喂食秀丽隐杆线虫时，线虫或被感染或被杀死；相反，当以益生菌乳酸菌为食物喂食秀丽隐杆线虫时，秀丽隐杆线虫平均寿命明显得到延长，同时还能使线虫抵御病原菌沙门氏菌能力得到增强(appliedandenvironmentalmicrobiology，2007，73:6404-6409)。此外，gusarov等以枯草芽孢杆菌喂食秀丽隐杆线虫时，发现秀丽隐杆线虫平均寿命通过胰岛素信号转导途径得到显著延长，并发现秀丽隐杆线虫寿命延长是由于枯草芽孢杆菌能通过一氧化氮合酶产生一氧化氮气体(cell，2013，152:818-830)。一氧化氮是人类已知的“最迷人的分子”。在20世纪90年代，对一氧化氮的研究成为一种风潮，世界各地的科学家对一氧化氮的兴趣愈加浓厚，研究也达到了一个新的高度。1992年，一氧化氮作为学术界的新发现，被著名的《科学》杂志评选为“年度明星分子”。1998年，美国的研究学者罗伯特·弗奇戈特、路易斯·伊格纳罗及弗里德·默拉德被授予诺贝尔生理医学奖。他们发现一氧化氮是心血管系统的信号分子，证实了一氧化氮作为信号分子在心血管系统中的作用，发现并论证了硝酸甘油及相关药物如何通过释放一氧化氮使身体健康，并对身体产生积极的作用。一氧化氮是重要的信号分子，它控制血压，调节血流量，使血液到达组织，为机体供应氧气和营养，事实上几乎所有的组织都离不开一氧化氮。越来越多的研究表明，一氧化氮在治疗心血管疾病和许多其他重大的慢性疾病中具有重要的作用。一氧化氮的主要生理功能包括对心血管系统、免疫系统、循环系统、中枢神经系统和泌尿生殖系统的作用(《一氧化氮让你远离心脑血管病》，原著louisj.lgnarro，主译：吴寿岭，杨刚虹；北京大学医学出版社出版，2007年)。

目前从黄豆不同部位分离的内生细菌主要分属芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)、肠杆菌属(enterobacter)、伯克氏菌属(burkholderia)、克雷伯氏杆菌属(klebsiella)、黄单胞菌属(xanthomonas)等(jitendradalal1andnikhileshkulkarni1，britishmicrobiologyresearchjournal，2013，3(1)：96-105)，人们从大豆中分离筛选内生菌的目的也只是为了农业生产需要。除了大豆中所含“非生物”类营养物质外，目前尚未见从大豆内生菌中筛选对人或其他动物起有益作用的内生菌的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供大豆内生菌及其应用，六种大豆内生菌分别来自于黑豆芽、黄豆种子和黄豆芽，且全部属于芽孢杆菌属；这六种大豆内生菌都能显著延长秀丽隐杆线虫的平均寿命，并提高秀丽隐杆线虫的抗热能力，并且均可在秀丽隐杆线虫体内定植；对人体抗衰老及延长寿命也有一定作用，可以在保健食品或药品中得到应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种大豆内生菌，为黑豆芽内生细菌，该黑豆芽内生细菌为地衣芽孢杆菌enb-bsys4(bacilluslicheniformis)，属于芽孢杆菌属，保藏号为cgmccno.10524。

一种大豆内生菌，为黑豆芽内生细菌，该黑豆芽内生细菌为解淀粉芽孢杆菌enb-bsys5(bacillusamyloliquefaciens)，属于芽孢杆菌属，保藏号为cgmccno.10525。

一种大豆内生菌，为黄豆种子内生细菌，该黄豆种子内生细菌为蜡样芽孢杆菌enb-sy3(bacilluscereus)，属于芽孢杆菌属，保藏号为cgmccno.10687。

一种大豆内生菌，为黄豆种子内生细菌，该黄豆种子内生细菌为地衣芽孢杆菌enb-sy8(bacilluslicheniformis)，属于芽孢杆菌属，保藏号为cgmccno.10688。

一种大豆内生菌，为黄豆芽内生细菌，该黄豆芽内生细菌为短小芽孢杆菌enb-sys1(bacilluspumilus)，属于芽孢杆菌属，保藏号为cgmccno.10689。

一种大豆内生菌，为黄豆芽内生细菌，该黄豆芽内生细菌为蜡样芽孢杆菌enb-sys2(bacilluscereus)，属于芽孢杆菌属，保藏号为cgmccno.10690。

本发明中的六种大豆内生菌：从黑豆芽分离的地衣芽孢杆菌enb-bsys4(baclicuslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌enb-bsys5(bacillusamyloliquefaciens)已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)保藏，保藏号分别为cgmccno.10524、cgmccno.10525；从黄豆种子分离的蜡样芽孢杆菌enb-sy3(bacilluscereus)、地衣芽孢杆菌enb-sy8(bacilluslicheniformis)以及从黄豆芽分离的短小芽孢杆菌enb-sys1(bacilluspumilus)、蜡样芽孢杆菌enb-sys2(bacilluscereus)，已于2015年4月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)保藏，保藏号分别为cgmccno.10687、cgmccno.10688、cgmccno.10689和cgmccno.10690。中国科学院微生物研究所菌种保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的六种大豆内生菌的分类学特征分别为：

(1)地衣芽孢杆菌enb-bsys4：菌落直径5～10毫米，中央粉色边缘浅白色不规则圆形，中央粉色发干，边缘乳白色湿润，在lb液体培养基中培养时，菌体在光学显微镜下呈小短直杆；

该菌株不能在50℃下生长，也不能在10℃下生长，但可在厌氧条件下生长。淀粉水解酶活性、硝酸盐还原及乳糖发酵产酸均呈阳性，溶血反应和吲哚反应呈阴性。利用api50ch试剂盒检测时，菌株enb-bsys4能利用甘油、l-阿拉伯糖、核糖、d-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-d-葡萄糖甙、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、密二糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、棉籽糖、淀粉、肝糖、d-松二糖、d-塔格糖和葡萄糖酸盐；不能利用赤癣醇、d-阿拉伯糖、l-木糖、阿东醇、β-甲基-d-木糖甙、半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、α-甲基-d-甘露糖甙、n-乙酰-葡糖胺、松三糖、木糖醇、龙胆二糖、乳糖、d-来苏糖、d-岩糖、l-岩糖、d-阿拉伯糖醇、l-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐。

(2)解淀粉芽孢杆菌enb-bsys5：菌落直径约5毫米，呈白色，中央突起水泡样边缘平坦发散，不易挑取，在lb液体培养基中菌体成短直杆，稍长；

该菌株淀粉水解酶活性阳性，硝酸盐还原阳性，溶血反应阳性，发酵乳糖产酸，12％氯化钠中生长。利用api50ch试剂盒检测时，菌株enb-bsys5能利用甘油、l-阿拉伯糖、核糖、d-木糖、l-木糖、阿东醇、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、α-甲基-d-葡萄糖甙、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、密二糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、松三糖、棉籽糖、淀粉、肝糖、d-松二糖、d-来苏糖和葡萄糖酸盐，api50ch试剂盒中的其余20种糖类则不能利用。

(3)蜡样芽孢杆菌enb-sy3：菌落直径约5毫米，白色菌落，不透明，磨砂状，中间稍有突起，外围平坦，边缘较整齐，较干燥。在lb液体培养基中菌体成短直杆，有的稍长；

该菌株在50℃下生长，硝酸盐还原阴性，柠檬酸盐阳性，过氧化氢阳性，精氨酸双水解阳性。利用api50ch试剂盒检测时，发现菌株enb-sy3能利用甘油、l-阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、肌醇、n-乙酰-葡糖胺、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和d-塔格糖，api50ch试剂盒中的其余33种糖类则不能利用。

(4)地衣芽孢杆菌enb-sy8：菌落直径约6毫米，中间浅粉色外围较浅发白，边缘不规则菌落，较湿润。在lb液体培养基中菌体成短小直杆；

该菌株在50℃下生长、淀粉水解酶活性阳性、硝酸盐阳性、柠檬酸盐阳性、乳糖发酵产酸阳性，精氨酸双水解阴性、溶血阴性、吲哚反应阴性。利用api50ch试剂盒检测时，发现菌株enb-sy8能利用l-阿拉伯糖、核糖、d-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-d-葡萄糖甙、n-乙酰-葡糖胺、七叶灵、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、淀粉、d-松二糖和d-塔格糖，api50ch试剂盒中的其余29种糖类则不能利用。

(5)短小芽孢杆菌enb-sys1：菌落直径约2～4毫米，偏圆形菌落，白色，较干燥，中央褶状凸起边缘均匀整齐。在lb液体培养基中菌体成短小直杆；

该菌株柠檬酸盐利用阳性、精氨酸双水解阳性，硝酸盐还原阴性、溶血阴性、淀粉产酸阴性，在ph5.5时可生长。利用api50ch试剂盒检测时，发现菌株enb-sys1能利用l-阿拉伯糖、核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-d-葡萄糖甙、n-乙酰-葡糖胺、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和d-塔格糖，api50ch试剂盒中的其余32种糖类则不能利用。

(6)蜡样芽孢杆菌enb-sys2：菌落直径约5毫米，白色菌落，不透明，磨砂状，中间稍有突起，外围平坦，边缘较整齐，较干燥。在lb液体培养基中菌体成中长杆，有的有分节；

该菌株硝酸盐还原阳性、柠檬酸盐利用阳性、溶血阳性、ph8可生长，精氨酸双水解阴性、10％氯化钠阴性。利用api50ch试剂盒检测时，发现菌株enb-sys2仅能利用核糖、葡萄糖、果糖、n-乙酰-葡糖胺、七叶灵、麦芽糖、蔗糖和海藻糖，api50ch试剂盒中的其余41种糖类则不能利用。

本发明公开了大豆内生菌在制备具有延长寿命、抗衰老作用的保健食品及药品中的应用。

本发明还公开了大豆内生菌在制备改善心血管疾病、免疫系统疾病、循环系统疾病、中枢神经系统疾病和泌尿生殖系统疾病的药品及保健食品中的应用。

其中，本发明的六种大豆内生菌的具体分离及筛选方法为：

将10粒用自来水流水清洗干净的黑豆和黄豆种子在70％酒精中浸泡3分钟，然后用无菌水冲洗后浸于3％次氯酸钠中5分钟，最后用无菌水冲洗后并浸泡4小时。从最后一次浸泡的无菌水中取100微升涂lb板作为对照，以此检验种子表面消毒是否彻底。之后将种子在研钵中研碎后取100微升接到lb液体培养基中，普通生化培养箱中37℃下预培养24小时。将培养液进行梯度稀释后涂lb平板，37℃培养1～2天。分别挑取形态不同的菌落进行纯培养，所挑出菌落进行平板划线，试验至少重复三次。同时，将最后用无菌水浸泡的种子置于黑暗处培养，待长出豆芽后，将豆芽用事先灭菌的刀切成1厘米长小段，采用上述同样的方法进行内生菌的分离。所得的纯培养物于50％甘油中-80℃冻存。对分离的单菌落进行菌体形态观察、生理生化及16srdna序列分析。将分离得到的黑豆、黄豆种子和豆芽中的内生菌分别喂食野生型秀丽隐杆线虫，研究不同食物对野生型秀丽隐杆线虫寿命及抗热性的影响。最终从黑豆芽内生菌中发现两株芽孢杆菌、黄豆种子中的两株芽孢杆菌、黄豆芽中的两株芽孢杆菌均能显著延长野生型秀丽隐杆线虫的平均寿命，并且均能显著提高野生型秀丽隐杆线虫抗热能力。本发明所用的野生型秀丽隐杆线虫以下简称秀丽隐杆线虫。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明中的六种大豆内生菌均能显著延长野生秀丽隐杆线虫的平均寿命、提高野生型秀丽隐杆线虫的抗热能力，并且均可在野生型秀丽隐杆线虫体内定植，其中四株大豆内生菌enb-bsys4、enb-bsys5、enb-sy8和enb-sys1可以产生no。本发明中的六种大豆内生菌对人体抗衰老及延长寿命也有一定作用，可以在保健食品或药品中得到应用，其中四种能产生no的大豆内生菌还可在制备改善心血管疾病、免疫系统疾病、循环系统疾病、中枢神经系统疾病和泌尿生殖系统疾病的药品及保健食品中得到应用。

由于no为信号分子，可在心血管系统、免疫系统、神经系统中发挥重要调节作用。故此，上述大豆内生菌一旦在人体内定植，则可通过产生no减少衰老性疾病发病率，提高机体免疫力和生活质量；对高血压病人，通过服用活菌菌剂则可起到降低血压，减少心脑血管发病率。由于两株不产no的蜡样芽孢杆菌喂食野生型秀丽隐杆线虫时，同样能延长秀丽隐杆线虫平均寿命和提高秀丽隐杆线虫抗热性，由此认为上述六株大豆内生菌还可能在定植后通过其他途径对秀丽隐杆线虫起到有益调节作用。此外，当芽孢菌株以营养体存在时，喂食秀丽隐杆线虫时，绝大部分芽孢杆菌营养体会被秀丽隐杆线虫“咬”碎而死亡，这样秀丽隐杆线虫就从这些被“咬碎”的菌体中获取营养物质，这些营养物也可以发挥秀丽隐杆线虫延寿作用。2013年日本学者komura，利用破碎后双歧杆菌喂食野生秀丽隐杆线虫时，发现秀丽隐杆线虫寿命也可以被延长，通过进一步试验，推测可能是菌体细胞壁和细胞质中间的某种磷壁酸组分对秀丽隐杆线虫起到了延寿作用。故此，上述六种对秀丽隐杆线虫有延寿作用的细菌做成高蛋白菌粉后，可能在提高人体免疫力方面发挥作用。

附图说明

图1为黑豆芽(a)、黄豆种子及黄豆芽(b)内生菌对秀丽隐杆线虫寿命的影响；

图2为大豆内生菌的系统发育树；

图3为大豆内生菌对秀丽隐杆线虫抗热能力影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。实施例中所用的线虫均为野生型秀丽隐杆线虫。

实施例1

1、大豆内生菌的分离

黑豆和黄豆种子购于保定市场。将10粒用自来水流水清洗干净的黑豆和黄豆种子在70％酒精中浸泡3分钟，然后用无菌水冲洗后浸于3％次氯酸钠中5分钟，最后用无菌水冲洗后并浸泡4小时。从最后一次浸泡的无菌水中取100微升涂lb板作为对照，以此检验种子表面消毒是否彻底。之后将种子在研钵中研碎后取100微升接到lb液体培养基中，普通生化培养箱中37℃下预培养24小时。将培养液进行梯度稀释后涂lb平板，37℃培养1～2天。分别挑取形态不同的菌落进行纯培养，所挑出菌落进行平板划线，试验至少重复三次。同时，将最后用无菌水浸泡的种子置于黑暗处培养，待长出豆芽后，将豆芽用事先灭菌的刀切成1厘米长小段，采用上述同样的方法进行内生菌的分离。将以上所得的纯培养物于50％甘油中-80℃冻存。并对分离的单菌落进行菌体形态观察、生理生化分析，并对菌落、菌体或生理生化特征有明显差异的菌株进行16srdna序列分析。

2、大豆内生菌的筛选

(1)菌种活化：将低温冷冻保存的所有大豆内生菌融化并按10％接种量接种到lb液体培养基中，37℃活化培养24小时。次日，将活化的菌种重新转接到新鲜的lb液体培养基中进行传代，培养12小时。

(2)野生型秀丽隐杆线虫活化：将-80℃冻存的野生型秀丽隐杆线虫取出，37℃迅速融化，离心，弃掉上清，将剩余虫体加到含有e.coliop50的ngm培养板上，20℃恒温培养。

(3)秀丽隐杆线虫标准食物e.coliop50的制备：挑取e.coliop50单菌落接入经过高压灭菌的新鲜的2毫升lb液体培养基中，37℃下180转/分钟震荡培养8～12小时，至od600为1.0左右时，吸取100微升菌液并均匀涂布到提前配制好的ngm平板的中央位置(距离平板边缘约0.5毫米)，于37℃倒置培养过夜，放4℃保存备用。

制备秀丽隐杆线虫液体培养用标准食物e.coliop50食物时，菌株e.coliop50的培养方法同上，只是在培养到od600为1.0左右时于4℃4000转/分钟离心10分钟，收集菌体，将得到的沉淀用s.medium培养液洗涤两次，弃去上清，加入s.medium培养液调整菌体浓度至od600为1.0左右，放4℃保存备用。

(4)秀丽隐杆线虫大豆内生菌食物的培养：分别将上述活化并传代好的大豆内生菌用移液枪吸取150微升涂布lb固体平板，37℃培养12小时。次日，用m9缓冲液将lb板上的菌体冲洗下来，收集到离心管中，将得到的沉淀用s.medium培养液洗涤两次，弃去上清，加入s.medium培养液调整菌体浓度至od600为1.0左右，放4℃保存备用。

(5)秀丽隐杆线虫的同步化：挑取未被杂菌污染的、处于产卵期成虫较多的秀丽隐杆线虫培养板，用m9缓冲液将虫体和卵冲洗下来，收集到离心管中，使每管的虫体量尽量一致，虫体密度不可过大。将含有产卵期成虫的离心管于4℃1500转/分钟离心1分钟，弃掉上清。再向上述离心管中每管加入650微升m9缓冲液和350微升现配的线虫裂解液，充分震荡混匀，直到用肉眼看不到虫体为止，立即取少量液体于显微镜下观察，确定是否只剩下虫卵，此过程不能超过10分钟，否则虫卵也会受到影响，甚至死亡。在观察到离心管中只剩下虫卵的瞬间，立即于4℃3500转/分钟离心30秒，弃掉上清。向上述离心管中加入m9缓冲液洗涤剩余沉淀，4℃3500转/分钟离心30秒，弃掉上清。重复上述洗涤步骤四次。将最后得到的秀丽隐杆虫卵吸取到上述含有e.coliop50的新鲜ngm平板(步骤(3))的边缘不含菌部分，20℃恒温培养，约48小时后，这些卵将发育成为同期化的l4期线虫，用于试验研究。

(6)秀丽隐杆线虫的寿命分析：将30条同步化后处于l4期的秀丽隐杆线虫分别转到添加含有500微升od600为1.0左右的不同大豆内生菌液体食物的24孔板中，20℃恒温培养，以添加e.coliop50液体食物的为对照，线虫条数为每孔30条。线虫每天转移到含相应的新鲜食物的孔中，死掉的虫子每天进行记录。秀丽隐杆线虫的寿命实验数据使用spss19.0的kalpan-meir存活曲线分析程序分析。

结果表明：从黑豆芽中筛选的两株内生菌、从黄豆种子中筛选的两株内生菌、从黄豆芽中筛选的两株内生菌均能显著延长野生型秀丽隐杆线虫的平均寿命，如图1所示。以标准食物e.coliop50喂食秀丽隐杆线虫时，线虫的平均生存时间为20.467±1.657天；以黑豆芽中分离的两株内生菌enb-bsys4和enb-bsys5喂食秀丽隐杆线虫时，线虫平均生存时间分别为30.517±1.608(p<0.001)和27.636±1.540(p<0.01)，秀丽隐杆线虫的寿命比喂食标准食物e.coliop50分别延长49.10％和35.03％；以黄豆种子中分离的两株内生菌enb-sy3和enb-sy8喂食秀丽隐杆线虫时，线虫平均生存时间分别为32.385±2.008(p<0.001)和36.353±1.790(p<0.001)，秀丽隐杆线虫的寿命比喂食标准食物e.coliop50分别延长58.23％和77.61％；以黄豆芽中分离的两株内生菌enb-sys1和enb-sys2喂食秀丽隐杆线虫时，线虫平均生存时间分别为26.714±1.405(p<0.05)和28.429±1.407(p<0.01)，秀丽隐杆线虫的寿命比喂食标准食物e.coliop50分别延长30.52％和38.90％。

根据16srdna序列对上述六株能显著延长秀丽隐杆线虫寿命的内生菌构建系统发育树，如图2所示。利用api50ch试剂盒对上述六株能延长秀丽隐杆线虫寿命的内生菌进行api检测，没有列在api50ch试剂盒中的指标(如淀粉水解酶活性等)按照jousimies-somer等细菌鉴定手册(2002年第6版，star出版公司)进行。根据菌株16srdna序列，结合菌落和菌体形态特征和生理生化指标检测结果，将黑豆芽中分离的两株能显著延长秀丽隐杆线虫寿命的内生菌enb-bsys4和enb-bsys5分别鉴定为地衣芽孢杆菌bacilluslicheniformis和解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens。用同样的方法，将将黄豆种子中分离的两株能显著延长秀丽隐杆线虫寿命的内生菌enb-sy3和enb-sy8分别鉴定为蜡样芽孢杆菌bacilluscereus和地衣芽孢杆菌bacilluslicheniformis；将黄豆芽中分离的两株能显著延长秀丽隐杆线虫寿命的内生菌enb-sys1和enb-sys2分别鉴定为短小芽孢杆菌bacilluspumilus和蜡样芽孢杆菌bacilluscereus。

3、大豆内生菌在秀丽隐杆线虫肠道定植的检测

黑豆和黄豆中的芽孢杆菌可以产生抗性极强的芽孢，其可以承受多种不良环境，因此，芽孢杆菌是有可能会定植于秀丽隐杆线虫肠道的。为了检测从黑豆和黄豆中筛选到的六株内生菌在饲喂秀丽隐杆线虫一段时间后能否定植于其肠道内，进行了如下实验：

将同步化后处于l4期的秀丽隐杆线虫用上述六株大豆内生菌分别喂食3天、一周及三周后按如下步骤进行表面消毒处理及培养：

(1)吸取24孔板中的秀丽隐杆线虫于1.5毫升的ep管中，加入m9缓冲液，1200g向心力下离心2分钟，弃上清，离心管中加入100微升70％酒精，对线虫表面消毒20秒，然后立即加入1毫升m9缓冲液(稀释酒精)。

(2)用m9缓冲液洗涤两次后，弃上清，在离心管中加入100微升10％次氯酸钠，对线虫表面消毒40秒，然后立即加入1毫升m9缓冲液(稀释次氯酸钠)，并再用m9缓冲液洗涤线虫两次。

(3)吸取表面消毒后的线虫管中的缓冲液100微升于灭菌的lb液体培养中，37℃培养并作为对照，检测线虫表面消毒是否彻底。

(4)剩余虫体和缓冲液用研磨棒捣碎(使虫体破裂，细菌溢出)，然后取100微升捣碎的虫体缓冲液于灭菌的lb培养基中37℃培养。

(5)如果步骤(3)中lb培养无菌生长说明线虫表面消毒彻底，那么步骤(4)中lb培养基中生长的菌体即为线虫体内的菌体，对该细菌进行涂板，获得单菌落，从菌落形态、16srdna基因序列验证该菌是否为喂食秀丽隐杆线虫的大豆内生菌。

将喂食3天大豆内生菌的线虫研碎后涂板，发现板上有两种菌落形态，一种类似于饲喂的大豆内生菌菌落，将此两种菌落分别纯化后，进行dna提取和16srdna测序并进行blast比对，结果发现两种菌分别为大肠杆菌和喂食的大豆内生菌；对喂食一周和三周的大豆内生菌的线虫研碎后涂板，发现平板上只有一种菌落形态，即喂食的大豆内生菌菌落，同样对其进行dna提取和16srdna测序，结果发现这一种菌就是喂食的大豆内生菌。综上所述，我们认为，黑豆和黄豆内生菌对秀丽隐杆线虫寿命的延长可能既与菌体本身提供的营养物质有关，也与菌体在线虫体内定植后发挥的有益调节作用有关。

4、大豆内生菌体外释放no测定

gusarov等于2013年发现，以枯草芽孢杆菌喂食野生型秀丽隐杆线虫时，线虫寿命得到显著延长，进一步研究发现，所喂食的枯草芽孢杆菌释放的no可以作为信号分子，通过ils途径来调控线虫的寿命(cell2013，152：818-830)。我们从中国科学院微生物研究所菌种保藏中心购买了一株枯草芽孢杆菌(菌株保藏号:cgmccno.1.4255)，当以该菌株喂食野生秀丽隐杆线虫时，发现与喂食e.coliop50的对照相比，对线虫寿命并没有明显的延长作用。通过硝酸盐/亚硝酸盐分析试剂盒测定，发现所购买的枯草芽孢杆菌几乎不产生no。因此，我们推测上述分离的对野生秀丽隐杆线虫有延寿作用的六株大豆内生菌很可能会产生no。

将预先培养12小时的上述六株大豆内生菌菌悬液，用一氧化氮试剂盒(南京建成)测定no生成，具体步骤如下：

(1)分别取100微升双蒸水作为空白管、标准品作为标准管、大豆内生菌菌悬液作为测定管。

(2)加入混合试剂400微升，混匀，37℃准确水浴60分钟。

(3)加入试剂三200微升，试剂四100微升，充分旋涡混匀30秒，室温静置40分钟，3500g向心力下离心10分钟。

(4)分别取上清500微升加600微升显色剂，混匀后室温静置10分钟进行显色。

(5)双蒸水调零，550纳米，0.5厘米光径，测定各管吸光度值。

(6)依据公式计算出no含量。

结果发现，两株黑豆内生菌enb-bsys4和enb-bsys5均可以产生no，平均含量分别为48.85μmol/l和44.04μmol/l。黄豆内生菌enb-sy8和enb-sys1也均产生no，平均含量分别为28.36μmol/l和73.24μmol/l，而黄豆内生菌enb-sy3和enb-sys2则不产生no。由于这六株对野生型秀丽隐杆线虫有延寿作用的芽孢杆菌属大豆内生菌均可在秀丽隐杆线虫肠道内定植，我们有理由认为，其中四株能产no的芽孢杆菌属大豆内生菌可能通过产no信号分子来调控秀丽隐杆线虫相关代谢，最终使得线虫得到显著延长。

5、大豆内生菌对秀丽隐杆线虫抗热能力影响

将上述同步化的l4期秀丽隐杆线虫分别添加到含不同大豆内生菌食物和标准食物e.coliop50的24孔板中，每孔含有e.coliop50菌悬液和大豆内生菌菌悬液各500μl，线虫30条/孔，每隔24小时将成虫转移到含对应的新鲜食物的新的24孔里面，20℃恒温培养。到第5天时，将其放于37℃条件下进行热应激试验，每隔2小时观察一次线虫存活情况。线虫死亡判断标准同上述秀丽隐杆线虫寿命试验，试验数据至少重复三次。

结果表明：黑豆芽中两株内生菌、黄豆种子中两株内生菌、黄豆芽中两株内生菌均显著提高野生型秀丽隐杆线虫的抗热能力，结果如图3所示。

当黑豆内生菌和e.coliop50喂食的秀丽隐杆线虫分别放于37℃下3～4小时，线虫开始死亡，当置于37℃下5、11和13小时，喂食e.coliop50的线虫、喂食黑豆内生菌enb-bsys4和enb-bsys5的线虫分别大量死亡，喂食不同食物的线虫平均生存时间分别为：喂食e.coliop50的线虫为5.37±0.31小时，喂食黑豆内生菌enb-bsys4和enb-bsys5分别为9.97±0.48and10.23±0.68小时。方差分析表明，喂食黑豆内生菌enb-bsys4和enb-bsys5的秀丽隐杆线虫较喂食e.coliop50的线虫具有显著的抗急性热应激能力(p<0.001)，如图3-a所示。

当黄豆内生菌和e.coliop50喂食的秀丽隐杆线虫分别放于37℃下2～4小时时，线虫开始死亡，当置于37℃下4、6、6和5小时时，喂食e.coliop50的线虫、喂食黄豆内生菌enb-sy3、enb-sy8、enb-sys1和enb-sys2的线虫分别开始大面积死亡，喂食不同食物的线虫平均生存时间分别为：喂食e.coliop50的线虫为4.73±0.34小时，喂食黄豆内生菌enb-sy3、enb-sy8、enb-sys1和enb-sys2分别为6.60±0.34、6.74±0.47、5.84±0.32和6.53±0.36小时。方差分析表明，喂食黄豆内生菌enb-sy3(p<0.01)、enb-sy8(p<0.01)、enb-sys1(p<0.05)和enb-sys2(p<0.01)的秀丽隐杆线虫较喂食e.coliop50的线虫具有显著的抗急性热应激能力，如图3-b所示。