本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种快速鉴定三角帆蚌性别的分子标记及鉴定方法。
背景技术：
三角帆蚌作为我国最主要的淡水育珠蚌，成活率高，产珠质量好，所产质量优良的珍珠可作为装饰品和工艺品，质量查的可作为药材。三角帆栖息于大、中型湖泊及河流内，但喜生活在水质清、水流急的水域，主要分布于江苏、浙江、江西、湖北、湖南和安徽等省份。性成熟三角帆蚌个体，雌雄间在产珠性能方面存在显著性差异，雄性具有更好的育珠性能，但在形态学上对三角帆蚌直观进行性别鉴定比较困难。目前鉴定性别的方法一般是采用沾取成熟三角帆蚌的性腺，通过在显微镜下观察配子来鉴别，但是这种方法仅适用于成熟的且处在繁殖期的三角帆蚌。幼龄三角帆蚌的鉴定对于淡水珍珠蚌的养殖是至关重要的。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种快速鉴定三角帆蚌性别的分子标记，将该分子标记应用于幼龄三角帆蚌的鉴定，对提高淡水珍珠蚌的养殖效益具有重要的作用。
本发明的另一目的在于提供一种快速鉴定三角帆蚌性别的分子标记方法，该方法简便快捷，对采样的要求低，鉴定结果准确性高，且不受组织特异性及环境的影响。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种快速鉴定三角帆蚌性别的分子标记方法，过程为：提取三角帆蚌的基因组dna，以提取的基因组dna为模板进行pcr扩增反应，对扩增结果进行纯化，测序，与核苷酸序列为seqidno.1的分子标记进行比对，若序列一致，则为雌性。其中，所用的分子标记的核苷酸序列seqidno.1为：aaacctccatattcgtatgtagcattaatagccatggccattaaggagtcccaagagaagcgactgacactcagcgggatttataacttcataatgaacaagtttccgtactatgaaaagaacaagaaggggtggcagaacagcatacggcacaatttaagcctgaatgaatgtttcgtgaaagtcccacgggaagggggcggtgaaagaaaggggaattattggacccttgaccctgcttttgaggatatgtttgagaaaggaaattatcgcagacgccgccgaatgaaaagaccctatcgaccagccttatcttttaagactttctttgcggacccaggtcattgctcaacatttggacaattcgctttttcaaaaaactacttctctccacctccgtattcgcaatattcgcaatat。该方法简便快捷，对采样的要求低，鉴定结果准确性高，且不受组织特异性及环境的影响，对提高淡水珍珠蚌的养殖效益具有重要的作用。
作为优选，pcr扩增反应过程中，上游引物序列为：aggcacgattcgtgtgtccc(如seqidno.2所示)；下游引物序列为：gctcaattcctcgaagctac(如seqidno.3所示)。上下游引物长度适当，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。
作为优选，pcr扩增反应过程中，取10×buffer2.5ul、dntp(10mmol/l)2.0ul、上下游引物(10pmol/l)各1ul、rtaq聚合酶0.3ul、dna模板100ng，加双蒸水至25ul；pcr扩增条件为：将混合物在94℃预变性5min，然后94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，进行35个循环，最后72℃延伸1min。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响rtaq酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少，所得的分子标记序列稳定一致。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明将核苷酸序列为seqidno.1的分子标记应用于幼龄三角帆蚌的鉴定，简便快捷，对采样的要求低，鉴定结果准确性高，且不受组织特异性及环境的影响，对提高淡水珍珠蚌的养殖效益具有重要的作用；所用的上下游引物长度适当，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明：
实施例1：
一种快速鉴定三角帆蚌性别的分子标记方法，包括以下步骤：
1)基因的提取：用苯酚-氯仿萃取法提取三角帆蚌的dna，并溶于te中，低温保存；
2)pcr扩增反应：扩增体系为：取10×buffer2.5ul、dntp(10mmol/l)2.0ul、上下游引物(10pmol/l)各1ul、rtaq聚合酶0.3ul、dna模板100ng，加双蒸水至25ul；pcr扩增条件为：将混合物在94℃预变性5min，然后94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，进行35个循环，最后72℃延伸1min；上游引物序列为：aggcacgattcgtgtgtccc，下游引物序列为：gctcaattcctcgaagctac；
3)测序比对：对扩增产物进行纯化测序，与核苷酸序列为seqidno.1的分子标记进行比对，若序列一致，则为雌性，不一致，则为雄性。
实施例2：
一种快速鉴定三角帆蚌性别的分子标记方法，包括以下步骤：
1)基因的提取：用苯酚-氯仿萃取法提取三角帆蚌的dna，并溶于te中，低温保存；
2)pcr扩增反应：取10×buffer2.5ul、dntp(10mmol/l)2.0ul、上下游引物(10pmol/l)各1ul、rtaq聚合酶0.3ul、dna模板100ng混合，加双蒸水至25ul，再加入1.2ng四氯扁桃酸和0.7ng肉桂酸甲酯；pcr扩增条件为：将混合物在94℃预变性5min，然后94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，进行35个循环，最后72℃延伸1min；上游引物序列为：aggcacgattcgtgtgtccc，下游引物序列为：gctcaattcctcgaagctac；所加入的四氯扁桃酸、肉桂酸甲酯与10×buffer具有协同作用，不仅能够提高rtaq聚合酶的催化活性，且能够提高dna合成时的保真性，降低错配率，进而提高了性别鉴定的准确性；
3)测序比对：对扩增产物进行纯化测序，与核苷酸序列为seqidno.1的分子标记进行比对，若序列一致，则为雌性，不一致，则为雄性。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110>金华职业技术学院
<120>一种快速鉴定三角帆蚌性别的分子标记
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>420
<212>dna
<213>三角帆蚌(hyriopsiscumingii)
<400>1
aaacctccatattcgtatgtagcattaatagccatggccattaaggagtcccaagagaag60
cgactgacactcagcgggatttataacttcataatgaacaagtttccgtactatgaaaag120
aacaagaaggggtggcagaacagcatacggcacaatttaagcctgaatgaatgtttcgtg180
aaagtcccacgggaagggggcggtgaaagaaaggggaattattggacccttgaccctgct240
tttgaggatatgtttgagaaaggaaattatcgcagacgccgccgaatgaaaagaccctat300
cgaccagccttatcttttaagactttctttgcggacccaggtcattgctcaacatttgga360
caattcgctttttcaaaaaactacttctctccacctccgtattcgcaatattcgcaatat420
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工合成(hyriopsiscumingii)
<400>2
aggcacgattcgtgtgtccc20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工合成(hyriopsiscumingii)
<400>3
gctcaattcctcgaagctac20