本发明属于基因序列和应用领域，具体涉及水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c及其编码蛋白。
背景技术：
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水稻是主要粮食作物之一，水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒(riceblack-streakeddwarfvirus，rbsdv)引起的水稻重要病毒病害，rbsdv由介体灰飞虱以持久不经卵方式传播。水稻被感染后，表现出典型的矮缩、分蘖少，叶色浓绿，叶背部、叶鞘甚至茎秆上有蜡白色至暗褐色条状脉肿等症状。21世纪以来，由于主推水稻品种对水稻黑条矮缩病抗性不足，江浙地区该病害的发生日益严重，特别是早播的单季晚稻秧田。该病害在江苏、浙江和河南的水稻产区呈爆发流行趋势。如2007年水稻黑条矮缩病首次在江苏粳稻上普遍发生，重病田连片绝收，2008年发病面积达2.67×105hm2，2009年则进一步上升到3.33×105hm2，给江苏水稻生产造成了严重的经济损失。
目前，防治水稻黑条矮缩病的方法主要是使用农药防治传毒介体灰飞虱，然而由于介体灰飞虱种群数量大，防治困难，而且随着用药时间变长，介体昆虫产生抗药性，导致防治效果不佳，并且使用农药存在环境污染这一问题，因此发掘抗性资源、培育抗病品种是防治该病害最为经济有效的手段。虽然到目前已经发现了一些抗性qtl，但是由于水稻黑条矮缩病的抗病资源少、抗性呈现数量遗传特征，且抗性包括抗虫性和抗病性，所以迄今为止尚无抗性基因被克隆的报道。
基因功能注释获得抗病基因是挖掘抗性基因的有效办法。通过对抗性qtl上的基因注释直接筛选出可能的候选基因，在抗、感亲本中比较候选基因的差异后再在f2群体中验证，并对结构和功能预测，从而筛选和分离抗性候选基因。之后对候选基因转化进行转基因验证，从而确定抗病基因能否提高水稻黑条矮缩病抗性。
技术实现要素：
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本发明目的之一是提供一个水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c。
本发明目的之二是提供用于扩增上述水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c的一对引物。
本发明目的之三是提供水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c的cdna序列。
本发明目的之四是提供水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c的编码蛋白。
为了实现上述目的，本发明才用了以下技术方案：
水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c，为序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列，seqidno：2为与序列表中seqidno：1所示序列90％以上同源性且具有与序列表中seqidno：1所示序列相同功能的核苷酸序列。
本发明涉及的水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c是利用抗感群体进行精细定位克隆获得的。本发明选择感病品种淮稻5号和抗病品种乌壳，构建f2和f2：3遗传群体，结合高密度遗传连锁图谱和f2表型鉴定结果，对抗病基因进行精细定位，获得水稻黑条矮缩病抗性qtl。借助水稻全基因组测序gramene数据库、生物信息学和高通量测序报告(http://www.gramene.org/；http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/；http://www.uniprot.org/)，对抗性qtls区段存在的基因进行基因注释和电子筛查，重点筛选r基因和防卫相关的抗病基因。对筛选到的基因在抗、感亲本和f2抗感群体中克隆并测序比对，都存在差异的选为候选目的基因。
用于扩增水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c的一对引物，分别具有序列表中seqidno：4和seqidno：5所示的核苷酸序列。
本发明根据已公布的水稻基因组序列，结合利用smart在线预测(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测基因结构，并根据预测结果的起始和终止编码序列，设计基因全长扩增引物一对分别为：序列表中seqidno：4和seqidno：5所示的核苷酸序列，分别利用抗、感亲本的总rna反转录后第一链作为模板进行pcr扩增，获得的抗、感亲本中基因rbsdv-6c的cdna，在抗/感材料中的基因rbsdv-6c的cdna(mrna)序列分别为序列表中seqidno：1(抗病亲本)和seqidno：2(感病亲本)，对抗、感亲本中基因的cdna序列进行比对和分析，rbsdv-6ccdna序列在抗、感亲本中存在4个位点差异。
上述seqidno：1所示的核苷酸序列为水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c的cdna序列。
上述seq所示水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c的编码蛋白为序列表中的seqidno：3所示的氨基酸序列。
本发明涉及的水稻黑条矮缩病抗病基因氨基酸序列是利用rbsdv-6c基因在抗/感材料中的cdna(mrna)序列，对抗、感亲本中rbsdv-6c核苷酸序列进行比对分析，rbsdv-6c在抗、感亲本中存在4个核苷酸的差异，分别经过editseq软件翻译获得抗/感材料中rbsdv-6c氨基酸(蛋白)序列seqidno：3(抗病亲本)和seqidno：4(感病亲本)，并对抗、感亲本中rbsdv-6c氨基酸序列进行比对分析，rbsdv-6c在抗、感亲本中存在1aa的差异，推测该差异导致抗病结构发生改变，从而导致基因的抗病性发生变化。
本发明具有如下有益效果：
本发明利用基因功能注释的方法对水稻黑条矮缩病的抗病基因rbsdv-6c进行精细定位和克隆，获得水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c，并研究该基因在抗、感亲本以及f2抗感群体中的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析和比对，获得水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c在抗、感亲本中的差异，通过转基因验证该水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c的功能。本发明提供的抗病基因rbsdv-6c具有重要的价值。
附图说明：
图1为淮稻5号/乌壳f2群体中rbsdv抗性qtl分析图。
图2为rbsdv-6c在抗感亲本中的核苷酸和氨基酸差异(图a为核苷酸差异；图b为氨基酸差异)。
图3为rbsdv-6c的抗性转基因t1代单株的基因表达量和病毒含量(图a为rbsdv-6c基因的转录水平；图b为病毒含量)。
具体实施方式：
下面通过具体实施案例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
实施例：水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c的获得
一、水稻黑条矮缩病抗病基因rbsdv-6c初定位
具体的定位方法包括以下步骤：
(1)水稻黑条矮缩病抗病基因定位研究亲本及遗传群体：
分别选择乌壳(父本)和淮稻5号(母本)为抗感亲本，构建超过2000株的f2群体和100个f2：3家系。
(2)水稻黑条矮缩病人工接种鉴定
将淮稻5号、乌壳和超过2000株的f2群体种子置于培养皿中，浸种催芽2d，分别播于500ml的一次性烧杯中，每杯播40粒，待苗长至2叶龄左右时，剔除弱苗，留下35株长势良好的苗用于接种，每个品种重复3次。根据灰飞虱的带毒率，按有效接种虫量4头/苗计算出实际接种虫量，接入带毒灰飞虱。接虫3d后扫出灰飞虱，缓1天后移栽到大田。一个月后开始调查发病情况，每7d调查一次，连续调查3次，准确计算发病率，分析乌壳的抗性遗传模式。
按照上述方法对100个f2：3家系进行水稻黑条矮缩病人工接种鉴定，准确计算发病率。
(3)抗性qtl精细定位
两亲本及f2群体的100个单株高通量测序(北京百迈客生物科技有限公司)，slaf-seq技术快速构建高密度遗传连锁图，图谱slaf标记数量为3835个，连锁群中相邻两标记遗传距离小于5cm的区域占总区域数比例为99.51％，总图距为1726.024cm，平均图距为0.45cm。结合f2：3家系水稻黑条矮缩病人工接种鉴定结果，在6号染色体上定位到水稻黑条矮缩病抗性qtlqrbsdv-6c。
表1抗性qtlqrbsdv-6c的染色体定位及统计学特征
二、候选基因的获得
(1)qtl区域候选基因的电子筛查
抗性qtlqrbsdv-6c通过遗传距离soap比对到基因组位置，获得400多个候选基因。结合高通量测序报告中给出的5个数据库基因功能注释信息(cog、go、kegg、swissprot、nr)初筛抗病相关基因，主要在go数据库中查看各种分子功能和参与的生物过程，在swiss-prot数据库查看编码蛋白类型，在kegg数据库中查看参与的信号通路，在cog数据库中查看其最相似蛋白。在gramene(http://www.gramene.org/)网站中获得基因序列，包括内含子、外显子、cdna、cds、5’utr和3’utr；blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)在ncbi蛋白质数据库进行同源性和保守结构域搜索；在smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)网站中预测编码蛋白质的功能域；在uniprot(http://www.uniprot.org/)网站中获得综合的蛋白质信息，如蛋白质功能、酶学特性、功能结构域及位点、基因家族、翻译后修饰情况、亚细胞定位及同一蛋白的所有相关报道的归纳总结。在候选区段内共筛查出78个与抗病相关的基因。
(2)候选基因的克隆、测序
根据gramene网站上获得的候选基因cdna或cds序列，在primerprimer5中设计引物，所设引物包含候选基因的全部cds区。为方便下一步构建表达载体，设计引物时分别在引物上、下游添加了合适的酶切位点。
采用trizol(reagent)提取感病亲本淮稻5号和抗病亲本乌壳的总rna时，利用试剂盒primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser进行反转录，获得第一链cdna。分别以获得的淮稻5号和乌壳的cdna为模板，以各候选基因的上下游引物进行pcr，根据cds的片段大小分别采用不同的酶扩增，产物＜2000bp用普通taqdna聚合酶或extaqdna聚合酶扩增，产物＞2000bp使用lataq或primerstargxl聚合酶扩增。各自的反应体系如下：
1)普通taqdna聚合酶pcr体系：
2)extaqdna聚合酶pcr体系：
3)primerstargxldna聚合酶pcr体系：
4)lataqdna聚合酶pcr体系：
其各自的反应程序如下：
1)普通taq、extaq和lataq聚合酶pcr反应程序：
2)primerstargxl聚合酶pcr反应程序：
pcr反应完毕后，primerstargxl酶额外加a尾才能连接到克隆载体pmd-18t上，即向含有pcr产物的薄壁离心管中再加入0.5μltaq酶和1.0μl(10mmeach)dntp，72℃延伸15min。最后，pcr产物在由0.5×tae缓冲液配制成的1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，150v电泳20min，溴化乙锭(eb)中染色10-15min，紫外灯下察看拍照后，切下含有目的片段的凝胶。用多功能dna纯化回收试剂盒回收目的片段，连接至pmd-18t克隆载体，热击法将连接产物转化至大肠杆菌，细胞悬液均匀涂布于lb固体培养基(含amp抗生素)上，37℃培养12-15h。挑取若干个大小适中、饱满圆滑的菌落，在含有500μl加有amp抗生素的lb液体培养基的2ml离心管内扩大培养，150rpm摇床37℃振荡培养3-5h。以培养后的菌液为模板，采用各候选基因对应的引物进行pcr验证，pcr反应体系如下：
1％凝胶中电泳检测pcr扩增结果，有正确目的片段且条带亮的即为阳性克隆。取200μl新鲜菌液送南京金斯瑞生物技术公司测序。为保证结果可靠性，每个样品至少送3管菌液，分别测序。
测序后，同时比对一个候选基因在3个样品中的基因序列，即淮稻5号、乌壳和已完成全基因组测序的日本晴，分别进行核苷酸序列和氨基酸序列的比对。序列比对在软件clustalx2.0中进行，比对结果在分析软件genedoc中查看。经统计分析发现有21个基因核苷酸未发现具有差异性，14个基因核苷酸有差异性但氨基酸未发现差异性，核苷酸和氨基酸差异都存在但是突变不在功能区的有18个，多次设计引物仍扩不到正确的乌壳基因的有13个，最终筛选到12个候选基因。
三、候选基因的结构和功能预测
对抗、感亲本间存在氨基酸差异的候选基因，进一步分析差异对其结构或功能域的影响，初步推测其对抗性可能的影响。分析包括：(1)差异是否改变蛋白同源序列：在ncbi网站的blastp中分析；(2)差异是否发生在结构或功能位点：通过interproscan数据库(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)中的功能位点进行判断；(3)差异对结构域的影响：在smart网站中，比较氨基酸突变前后基因序列的结构域，判断其对结构域的影响。分析发现12个候选基因的抗感氨基酸差异影响基因结构或发生在功能位点内。
进一步验证候选基因在淮稻5号/乌壳的f2代极抗和极感群体是否发生遗传交换，通过双重验证确定氨基酸差异的可靠性。从f2代的100株作图群体中各取10株经人工接种鉴定表现为极抗(发病率＜33％)和极感黑条矮缩病(发病率＞80％)的单株叶片，ctab法提取单株叶片的总dna。按照碱基或氨基酸差异的位点，在基因dna序列差异位点的两侧翼设计引物，选择目的片段大小合适且包含差异位点的引物。分别以双亲本和f2代中选取的各抗、感单株的dna为模板，以包含突变位点的dna片段为上下游引物，采用普通dnataq酶体系进行pcr，t-a克隆并测序，序列比对与结果分析分别在软件clutalx2.0和genedoc中进行，根据序列比对结果判断遗传交换的发生。进一步验证了12个候选基因氨基酸突变的稳定性与一致性。
四、候选基因转化水稻和转基因植株的筛选
基于双重验证和功能预测的结果，将12个候选基因分别插入经改造的以玉米泛素ubi为启动子，以潮霉素基因为选择标记的植物双元表达载体pcambia1301，构建植物转化载体，经农杆菌介导的方法将候选基因转化至感病亲本淮稻5号，成功收到8个转基因株系。
五、转基因植株的验证
得到转基因植株后，采用trizol一步法提取植物总rna，利用去基因组反转录试剂盒反转录得到第一链cdna，用潮霉素特异性引物和目的基因引物筛选获得阳性植株，用实时荧光定量pcr测定转基因t0代候选基因的转录水平。根据候选基因的转录水平高低，挑选出表达量较高的和表达量较低的t1代进行人工接种抗性鉴定。鉴定结果显示转化基因qrbsdv-6c的1个line的发病率与转基因受体淮稻5号相比有显著差异，抗性显著提高。同时测定这个line中抗病单株的候选目的基因转录水平和病毒含量，结果显示基因表达量的变化与病毒含量变化相关。
上述阳性植株筛选所用扩增反应的反应体系(20μl)中含有：2μl模板第一链，10μl2×pcrmix，0.5μm上游引物，0.5μm下游引物，7μlddh2o。
pcr反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃45s，56℃45s，72℃90s，共35个循环；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保存。
实时荧光定量pcr反应的反应体系(20μl)中含有：2μl模板第一链，10μl2×sybr，0.5μm上游引物，0.5μm下游引物，7μlddh2o。
实时荧光定量pcr反应程序为：阶段1：95℃预变性15min；阶段2：94℃15s，58℃30s，79℃30s，共45个循环；阶段3：65℃30s，共61个循环。
表3qrbsdv-6c的部分t1代人工抗性鉴定结果
注：上述上标小写字母表示差异显著性(p＜0.05)，上述上标大写字母表示差异极显著性(p＜0.01)。