一种PCR扩增方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种pcr扩增方法。

背景技术：

pcr是一种体外核酸扩增技术，理论上可以在1-2h之内将目标dna序列从几个拷贝扩增到几百万倍。然而，对有些序列进行扩增时，会出现扩增产率与检测灵敏度较低的现象。于是，很多研究想通过一些方法提高pcr扩增的灵敏度或产率。

中国专利cn106591287a、cn105861491a、cn105861489a、cn105420364a、cn105420364a等通过向pcr体系外加己六醇、海藻糖、甜菜碱、乙二醇、山梨醇、石墨烯、聚乙烯亚胺等物质增强pcr的性能。但是，这些物质的作用机理未知，大多仅是推测，往往不同的pcr体系所添加的量都不同，想要达到较好的效果就必须针对每个体系进行添加量的优化，可想而知，即使达到了最终预期的效果也极不便利。

因此，需要开发一种新的pcr扩增方法，提高pcr扩增的产率和灵敏度。

技术实现要素：

本发明提供了一种pcr扩增方法，该方法为：

将dna模板、引物、聚合酶、dntp、缓冲液等混合构成pcr体系，进行预变性，变性、退火、延伸三个步骤的循环，延伸等步骤，将目的片段进行扩增；

其中所述的引物为巯基化修饰的引物；

巯基化修饰的引物是在引物合成之后，用巯基己醇与引物5′端的磷酸基团发生酯化反应实现的。巯基化修饰后的引物用hplc进行纯化，然后冷冻干燥。

引物的合成和巯基化修饰均可以委托基因合成公司完成。

也就是说，除了将引物进行巯基化修饰，其他步骤和常规的pcr体系和扩增步骤一样：

pcr体系可以为10-50μl，包含1xpcr缓冲液、1-2mmmgcl2、200-400nm巯基化修饰的正反向引物、0.05-0.2mmdntp、1-2u聚合酶，等。和普通pcr的步骤一样，进行预变性，变性、退火、延伸三个步骤的循环，延伸等步骤，将目的片段进行扩增。其中90-95℃预变性2-10min，变性(90-95℃，15-60s)、退火(45-65℃，15-60s)、延伸(65-75℃，30-120s)三个步骤循环30-40次，最后65-75℃延伸5-10min。pcr扩增结果用0.5％-3％的琼脂糖凝胶进行电泳，最终染色观察pcr产物条带。

本发明的pcr扩增方法具有如下优点：

1、无需额外添加其他成分来增强pcr属性，不涉及添加物量的优化；

2、仅仅通过引物修饰就可以实现pcr扩增灵敏度与扩增产量的提高；

3、本方法具有普适性，无特殊要求。

附图说明

图1引物巯基化修饰提高沙门氏菌基因组dnapcr扩增的灵敏度

a：引物未巯基化修饰；b：引物巯基化修饰；m：dnamarker；

1-7：沙门氏菌dna依次十倍稀释后取2μl作为模板进行扩增，初始浓度为70ng/μl；8：阴性对照

图2引物巯基化修饰提高副溶血弧菌基因组dnapcr扩增的灵敏度

m：dnamarker；1-9与11-19：副溶血弧菌基因组dna依次十倍稀释，取1μl作为模板进行扩增，初始浓度为50ng/μl；10与20：阴性对照；

1-10所用引物未巯基化修饰；11-20所用引物为巯基化修饰的引物。

图3引物巯基化修饰提高副溶血弧菌基因组dnapcr扩增的产量

m：dnamarker；2-6与8-12：取1μl浓度为500pg/μl的副溶血弧菌基因组dna作为模板进行扩增；1与7：阴性对照。1-6所用引物未巯基化修饰；7-12所用引物为巯基化修饰的引物。

具体实施方式

以下结合附图通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：引物进行巯基化修饰提高沙门氏菌基因组dnapcr检测的灵敏度；

将沙门氏菌(cmcc50115，购自环凯微生物)在lb培养基中摇瓶过夜培养，取1ml菌液，用细菌基因组dna提取试剂盒(购自上海生工生物工程股份有限公司)进行提取，最终提取的基因组dna母液-20℃保存，使用时稀释。

将沙门氏菌基因组dna(初始浓度约为70ng/μl，)依次十倍稀释，分别取2μl作为模板进行pcr扩增。pcr体系为25μl，体系的组成为：1×pcr缓冲液、1.5mmmgcl2、0.1mmdntp、400nm引物sa375s-r/f(5′ggaaccatcacggacaatac3′，5′gccatcggcaagataacg3′，5′端均巯基化修饰，引物合成与修饰均由上海生工生物工程股份有限公司完成)、1.0utaqdna聚合酶。

pcr程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，重复这三个步骤共35个循环，然后72℃继续延伸8min。最终产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，4sredplus核酸染色剂染色后观察结果。

由图1可以看出：和未修饰的引物相比，经过巯基化修饰的引物对沙门氏菌基因组dna检测灵敏度更高。经过巯基化修饰之后pcr灵敏度增加了至少100倍。

实施例2：对引物进行巯基化修饰提高副溶血弧菌基因组dnapcr检测的灵敏度；

将副溶血弧菌(atcc17802，购自环凯微生物)在加盐lb培养基中摇瓶过夜培养，取1ml菌液，用细菌基因组dna提取试剂盒(购自上海生工生物工程股份有限公司)进行提取，最终基因组dna母液-20℃保存，使用时稀释。

将副溶血弧菌基因组dna(初始浓度约为50ng/μl)依次十倍稀释，分别取1μl作为模板进行pcr扩增。pcr体系为20μl，体系的组成为：1×pcr缓冲液、1.5mmmgcl2、0.1mmdntp、400nm引物v451s-r/f(5′ggtgtctttccaatcctttc3′，5′ggtatcgaacaactgtagcg3′，5′端均巯基化修饰，引物合成与修饰均由上海生工生物工程股份有限公司完成)、1.0utaqdna聚合酶。

pcr程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，重复这三个步骤共35个循环，然后72℃继续延伸8min。最终产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，eb(溴化乙锭)染色后观察结果。

由图2可以看出经过巯基化修饰的引物和未修饰的引物相比检测灵敏度更高。前者最低可以从50pg/μl的副溶血弧菌基因组dna溶液中取1μl作为模板进行pcr检测到信号，而后者最低从500fg/μl的副溶血弧菌基因组dna溶液中取1μl作为模板进行pcr可以检测到信号。也就是说，经过巯基化修饰之后pcr灵敏度至少可以增加100倍。

实施例3：对引物进行巯基化修饰，提高pcr检测的产率；

将副溶血弧菌(atcc17802，购自环凯微生物)在加盐lb培养基中摇瓶过夜培养，取1ml菌液，用细菌基因组dna提取试剂盒(购自上海生工生物工程股份有限公司)进行提取，最终基因组dna母液-20℃保存，使用时稀释。

将副溶血弧菌基因组dna(初始浓度约为500pg/μl)取1μl作为模板进行pcr扩增。pcr体系为20μl，体系的组成为：1×pcr缓冲液、1.5mmmgcl2、0.1mmdntp、400nm引物v451s-r/f(5′ggtgtctttccaatcctttc3′，5′ggtatcgaacaactgtagcg3′，5′端均巯基化修饰，引物合成与修饰由上海生工生物工程股份有限公司完成)、1.0utaqdna聚合酶。

pcr程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，重复这三个步骤共35个循环，然后72℃继续延伸8min。最终产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，eb染色后观察结果。

由图3可以看出经过巯基化修饰的引物和未修饰的引物相比，巯基化修饰的引物可以得到更多的扩增产物，差别非常明显。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。