一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系及其构建方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体nectin-4的细胞系及其构建方法。

背景技术：

小反刍兽疫(pestedespetitsruminants,ppr)是由小反刍兽疫病毒(pestedespetitsruminantsvirus,pprv)引起的一种急性、高度接触性传染病，主要感染绵羊、山羊等小反刍兽。世界动物卫生组织将其规定为必须上报的疫病，我国将其列为一类动物疫病。该病导致动物的急性发病率和死亡率严重时可分别高达100％和90％。近年来ppr呈现扩散的趋势，我国周边的印度、巴基斯坦等国家均暴发过大规模的疫情。

2007年7月，我国西藏地区首次发生了ppr疫情，随即被有关部门迅速扑灭，引起了国家的高度重视。在随后的数年里，我国新疆及西藏地区零散发生了数起ppr疫情。2014年3月，我国的内蒙古、辽宁省、湖南省、江西省、江苏省以及安徽省发生了多起疑似ppr疫情，经国家外来动物疫病研究中心确诊为ppr疫情，这为我国ppr防疫工作再次敲响了警钟！由于目前对于该病尚无特效的治疗方法，主要依靠疫苗进行免疫预防。由于该病具有高发病率和死亡率的特点，ppr疫情给养羊业造成了巨大的危害。作为一种重大的跨国动物传染病，严重威胁着我国畜牧业经济的发展。因此，加强对该病的研究工作具有重要的现实意义。2017年，研究人员在中国安徽省的野生动物河麂体内发现了pprv感染，野生动物携带pprv不利于该病毒的消灭计划，提示对于该病的防治工作任重而道远。

pprv属于副粘病毒科麻疹病毒属成员，为单股、负链、不分节段的rna病毒。pprv仅有1个血清型，分为4个群。病毒基因组从3′端至5′端依次包含6个基因，对应编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白(n、p、m、f、h、l结构蛋白，以及c和v非结构蛋白)。其中h蛋白具有神经氨酸酶活性和血凝素活性，能够引起感染的细胞出现细胞病变(cpe)。在pprv感染细胞的过程中，h蛋白首先与宿主细胞受体结合，启动病毒对细胞的感染。科研人员新近发现nectin-4为pprv感染宿主上皮细胞的受体。nectin-4又名脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白，属于ig球蛋白超家族中的nectin家族。截至目前，h蛋白如何与受体nectin-4相互作用的分子机制尚不清楚，有待深入研究。为深入研究h蛋白与受体nectin-4的相互作用，有必要构建稳定表达nectin-4蛋白的细胞系。

nectin-4蛋白是pprv新的受体，能够与构成pprv囊膜表面纤突的h蛋白存在相互作用，为进一步有待深入研究二者的相互作用，有必要构建过表达病毒受体nectin-4的细胞系。adombi等曾经利用构建的稳定表达slam的猴cv1细胞系从病料样品中快速、敏感地分离出pprv。因此，构建稳定表达nectin-4受体细胞系能够为临床快速分离病毒提供重要的材料，具有重要的现实意义。

目前，建立细胞系有多种方法，如直接利用脂质体转染将表达质粒转染靶细胞然后进行筛选获得，但直接转染的方法往往效率不高。慢病毒系统由于能够感染分裂细胞及非分裂细胞，外源基因容量较大，目的基因表达时间较长，不易引发宿主免疫反应等诸多优点，逐渐成为稳定表达外源蛋白细胞系构建的热点。慢病毒细胞系中由于带有嘌呤霉素抗性基因，使用嘌呤霉素筛选时，能够正常存活，而正常对照293t细胞则由于不具备嘌呤霉素抗性而发生死亡。从而有利于快速、高效构建稳定表达外源蛋白的细胞系。

技术实现要素：

为了弥补以上不足，本发明提供了一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体nectin-4的细胞系及其构建方法。

本发明的方案是：

一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体nectin-4的细胞系，所述细胞系为mdbk-nectin-4细胞系，所述细胞系整合了小反刍兽疫病毒受体nectin-4基因，所述细胞系能稳定高效表达nectin-4基因。

一种稳定表达所述小反刍兽疫病毒受体nectin-4的细胞系的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用基因重组技术将小反刍兽疫病毒受体nectin-4基因克隆到慢病毒表达系统plov-egfp载体中，得到重组表达载体plov-egfp-nectin-4；

(2)将构建好的重组表达载体plov-egfp-nectin-4与包装质粒pspax2和外膜质粒pmd2.g通过脂质体共转染293t细胞，通过嘌呤霉素筛选出阳性重组细胞系；

(3)对阳性细胞系进行westernblot和ifa鉴定，得到稳定表达小反刍兽疫病毒受体nectin-4的细胞系。

进一步地，所述步骤(1)具体为：先根据小反刍兽疫病毒受体nectin-4基因，设计带有xmai和xbai双酶切位点及保护碱基的小反刍兽疫病毒受体nectin-4的特异引物，再通过pcr反应从合成的nectin-4模板中扩增含有特异性酶切位点的小反刍兽疫病毒受体nectin-4基因，然后在慢病毒表达系统plov-egfp载体的xmai和xbai多克隆位点插入小反刍兽疫病毒受体nectin-4基因，得到重组表达载体plov-egfp-nectin-4。

进一步地，所述特异引物的序列为：

上游引物f(seqidno.1)：

5’-tccccccgggatgcctctgtccctgggagccg-3’

上游引物r(seqidno.2)：

5’-gctctagagaccagatgcccccgcccgttgat-3’。

进一步地，所述pcr的反应体系为：上下游引物各2μl、模板dna1μg、rtaqdna聚合酶(mix)50μl，加双蒸水补齐至100μl。

进一步地，所述步骤(2)具体为：将构建好的重组表达载体plov-egfp-nectin-4先与包装质粒pspax2和外膜质粒pmd2.g通过脂质体共转染293t细胞，再通过含嘌呤霉素筛的培养基筛选出阳性细胞系。

进一步地，所述步骤(3)中一抗为鼠源nectin-4多抗血清。

进一步地，所述步骤(3)中ifa的二抗为fitc标记的羊抗鼠igg抗体，westernblot的二抗为hrp标记的羊抗鼠igg抗体。

进一步地，所述步骤(3)取第5、10、15和20代次的mdbk-nectin-4细胞进行westernblot和ifa检测，以鉴定nectin-4蛋白的表达。将上述代次的mdbk-nectin-4细胞系反复冻融3次，裂解后进行sds-page电泳。将蛋白转印至硝酸纤维素膜后，依次与鼠源nectin-4多抗血清(1:200倍稀释)和hrp标记的羊抗鼠igg抗体(1:2000)反应，利用ecl化学发光试剂盒进行显色。将上述代次的mdbk-nectin-4细胞系用丙酮和甲醇的混合液固定，然后进行ifa检测。一抗为鼠源nectin-4多抗血清(1:200倍稀释)，二抗为fitc标记的羊抗鼠igg抗体(1:1000倍稀释)，荧光显微镜下观察结果。

有益效果

1.本发明首先根据绿色荧光蛋白来观察慢病毒颗粒的成功包装。然后再利用嘌呤霉素抗性加压筛选，得到能够稳定表达nectin-4蛋白的mdbk-nectin-4细胞系。该细胞系一方面能够稳定传代20代，表现出良好的遗传稳定性。另一方面相对于亲本mdbk细胞而言，在同样剂量的pprv感染过程中，能够更加快速的表现出cpe，有利于临床pprv的病毒分离工作。

2.本发明通过慢病毒包装系统成功构建了稳定表达pprv受体nectin-4蛋白的mdbk-nectin-4细胞系。通过蛋白水平检测，该细胞系能够稳定高效表达nectin-4蛋白，为研究pprv与受体nectin-4的相互作用以及临床快速分离pprv提供了重要的平台。

附图说明

图1nectin-4基因pcr扩增产物电泳图，其中m为dl2500marker；1为nectin-4pcr扩增产物。

图2plov-egfp-nectin4质粒双酶切电泳图，其中m为dl15000marker；1为plov-egfp-nectin4质粒双酶切产物。

图3plov-egfp-nectin-4、pspax2和pmd2.g共转染293t细胞荧光图，其中a为普通显微镜下观察三质粒共转染24h后细胞的形态；b为荧光显微镜下观察三质粒共转染24h后的荧光。

图4mdbk-nectin-4细胞中nectin-4基因检测图，其中m为dna分子质量标准；1为第10代mdbk-nectin-4细胞；2为mdbk细胞。

图5westernblot检测不同代次mdbk-nectin-4细胞中nectin-4蛋白的表达图，其中1为mdbk细胞裂解液；2、3、4、5分别为mdbk-nectin-4细胞第5、10、15和20代mdbk-nectin-4细胞裂解液。

图6ifa检测mdbk-nectin-4中nectin-4蛋白的表达，a、b、c、d分别为传代至第5、10、15、20代的mdbk-nectin-4中nectin-4蛋白的表达；绿色荧光为nectin-4的位置，蓝色为dapi染色的细胞核。

图7pprv感染mdbk及mdbk-nectin4细胞系，a、b分别为pprv感染mdbk-nectin4细胞48、96h的cpe；c、d分别为pprv感染mdbk细胞48、96h的cpe。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例及附图1～5对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定，实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。

1.plov-egfp-nectin-4表达载体构建

根据genbank公开发表的羊源nectin-4基因序列(登录号jx944709)合成nectin-4基因。

所述nectin-4基因序列(seqidno.3)：(登录号jx944709)

atgcctctgtccctgggagccgagatgtggggtcctgtggcctggctgctgctgctgctcctggcatcatttacaggtcagtgccttgctggtgagctggagacctcggacctggtgaccgtggtgctgggccaggatgccaggctgccctgcttctaccgaggggatccgggcgagcaggtggagcaggtggcatgggctcgcgtggatgcgggcgagggcggccgggaactggcactgctgaactccaaatacgggctgcacgtgagctcagcctacgagggccgcgtggaacagccgccgcccccacggaaccccctggatggtgcggtactgctgcgcaacgcggtgcaggctgacgagggcgagtacgagtgtcgcgtcagcaccttccctgccggaagcttccaggcaaggctgcggctccgcgttctggtgcctcccttgccctcgctgaatcctggtccggcgctagaagagggccagggcctgacactggcagcctcctgcacagcagagggcagcccggcccccagcgttacctgggacacagaggtcaagggcacagcatcccaccgctccttcacacactcccgctcagctgccgtcacttcagaattccatctggtgcccagccgcagcatgaacggacagccacttacctgcgtggtatcccaccctggcctgctgcaggaccaacggatcacccacatcctccaggtggccttccttgcggaagcctctgtgaggggccttgaagaccgaaagctgtggcaggttggcagagaaggggctatgctcaagtgcttgagtgaagggcagcccccgccctcgtacaactggacacggctggacgggcctctgcccagtggggtacgagcagaaggagacaccctgggcttccccacactgaccactgagcacagtggcacatacgtctgccgtgttagcaatgcactctcctcaagggattctcaggtggtggtggacgttcttgaccccgaggatgccgccgggaagcaggtggacctcgtgtcggcctccgtggtagtggtgggcgtaattgctgcactcttgttctgccttctggtggtggtcgtggtgctcatgtcccgataccatcggcgcaaggcccagcagatgacccagaaatatgaggaggagctgaccctgaccagggagaactccatccggaggctgcattcccatcactcggaccccagaaaccagccggaggagagtgtagggctgagagccgagggccaccccgatagtctcaaggacaacagtagctgctctgtgatgagtgaagagccggagggccgcagttactccacgctgaccacagtgagggagattgaaacgcagaccgagctgccgtctccaggccctgggcgggcagaggaggaggaggatcgggatgaaggcatcaagcaggccatgaaccattttgttcaggagaacgggaccctgcgggccaagcccacgggcaatggcatctacatcaacgggcgggggcatctggtctga

同时设计一对pcr特异性引物，去除了nectin-4基因的终止密码子tga，并在两端添加xmai和xbai酶切位点。引物序列见表1。

表1.pcr扩增nectin-4的特异性引物

利用pcr扩增含有酶切位点的nectin-4基因，所述pcr的反应体系为：上下游引物各2μl、模板dna1μg、rtaqdna聚合酶(mix)50μl，加双蒸水补齐至100μl。pcr产物切胶回收后利用xmai和xbai双酶切，将其亚克隆至同样经双酶切的慢病毒表达系统plov-egfp载体中。重组质粒经pcr、酶切鉴定正确后送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。重组质粒经鉴定后命名为plov-egfp-nectin-4。

以合成的pmd18-t-nectin-4质粒为模板，根据材料和方法1.4，成功扩增出1530bp目的片段，与预期大小相符，结果见图1。构建获得真核表达质粒plov-egfp-nectin-4经xmai和xbai双酶切后生成大小约为8500bp载体和1530bp目的基因条带，结果见图2，表明质粒构建成功。测序结果表明，nectin-4基因未发生碱基突变或缺失。

2.慢病毒样颗粒的制备

提取无内毒素的plov-egfp-nectin-4重组质粒以及pspax2和pmd2.g质粒，分别按照25、15和25μg的量利用lipofectamine2000转染试剂共转染293t细胞，具体操作步骤参见lipofectamine2000转染试剂说明书。转染24h后收集含慢病毒样颗粒的细胞培养上清液。

3.嘌呤霉素对mdbk细胞最小致死浓度测定

将mdbk细胞以约1.0×105个/瓶的浓度接种于25ml细胞瓶。在将其置于5％co2、37℃培养箱中培养48h左右，当细胞长成70％～80％满的单层细胞时，每组细胞分别添加1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml和5μg/ml浓度的嘌呤霉素，每48h换液一次。利用含嘌呤霉素抗性培养基培养约10d，然后利用不加嘌呤霉素的培养基继续培养3d。实验每组设置3个重复。期间无细胞存活的嘌呤霉素的最小浓度即为对mdbk细胞的最小致死浓度。

实验结果表明，加入不同浓度的嘌呤霉素24h后，mdbk细胞出现明显的生长停滞。第3d时mdbk细胞出现大量的死亡，培养至第5d几乎没有正常形态的mdbk细胞的存在。当第10d时，1μg/ml组中仅有极少量mdbk细胞存活，而2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml和5μg/ml组中mdbk细胞均死亡。因此，确定嘌呤霉素对mdbk细胞的最小致死浓度为2μg/ml。实验中采用1μg/ml的嘌呤霉素作为筛选工作浓度。

4.表达nectin-4细胞系的构建与筛选

将含慢病毒样颗粒的293t细胞培养上清感染mdbk细胞。感染24h后，重复感染一次。第二次感染24h后，用含1μg/ml工作浓度的嘌呤霉素培养基进行筛选，每隔1d弃去细胞培养上清液，更换含嘌呤霉素的新培养液。用含工作浓度的嘌呤霉素培养基连续传5代进行加压筛选。

5.nectin-4基因组mrna转录水平检测

提取第10代mdbk-nectin-4细胞的基因组总rna，用m-mlv反转录获得cdna，并以cdna为模板，用引物nectin-4-up和nectin-4-dw进行pcr扩增。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，rt-pcr检测第10代mdbk-nectin-4细胞能测出nectin-4基因，而mdbk细胞中未检测出，结果见图4。从而表明，nectin-4基因能在mdbk-nectin-4细胞中转录成mrna。

7.mdbk-nectin-4细胞系遗传稳定性检测

将mdbk-nectin-4细胞系进行传代至第20代。期间取第5、10、15和20代次细胞，将细胞反复冻融裂解后，分别进行westernblot鉴定，方法同4。同时设置mdbk细胞作对照，结果见图5。

将mdbk-nectin-4细胞传代至第20代，分别取第5、10、15和20代次细胞，利用ifa实验观察nectin-4的表达。结果表明，传至第20代的mdbk-nectin-4细胞依然能够稳定表达nectin-4蛋白，且nectin-4蛋白主要分布在细胞膜上，结果见图6。

8.pprv感染mdkb-nectin-4细胞系实验

pprv以0.1moi的量接种长成单层的mdbk-nectin-4细胞系，病毒吸附1h后更换为含2％fbs的dmem维持液培养5～6d，同时设置mdbk细胞接种pprv作对照。每天观察比较mdbk-nectin-4细胞系和mdbk细胞出现cpe的时间。

pprv感染mdbk-nectin-4细胞后48h即出现一定程度的cpe，96h后出现了明显的cpe。对照组mdbk细胞在接种pprv后96h才开始形成一定程度的cpe，结果见图7。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。

序列表

<110>安徽农业大学

<120>一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体nectin-4的细胞系及其构建方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>人工引物序列(未知)

<400>1

tccccccgggatgcctctgtccctgggagccg32

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工引物序列(未知)

<400>2

gctctagagaccagatgcccccgcccgttgat32

<210>3

<211>1530

<212>dna

<213>绵羊(ovisaries)

<400>3

atgcctctgtccctgggagccgagatgtggggtcctgtggcctggctgctgctgctgctc60

ctggcatcatttacaggtcagtgccttgctggtgagctggagacctcggacctggtgacc120

gtggtgctgggccaggatgccaggctgccctgcttctaccgaggggatccgggcgagcag180

gtggagcaggtggcatgggctcgcgtggatgcgggcgagggcggccgggaactggcactg240

ctgaactccaaatacgggctgcacgtgagctcagcctacgagggccgcgtggaacagccg300

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tctccaggccctgggcgggcagaggaggaggaggatcgggatgaaggcatcaagcaggcc1440

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tacatcaacgggcgggggcatctggtctga1530