本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种寄生曲霉的afg2产毒发酵方法。
背景技术：
黄曲霉毒素(aflatoxins，afs)是由寄生曲霉、黄曲霉和集峰曲霉等其中的一些产毒真菌产生的次生代谢产物，具有致癌、致畸和致突变等三致作用。据文献报道，已鉴定出的afs多达20余种，其中最为常见的是afs是黄曲霉毒素b1(afb1)、黄曲霉毒素b2(afb2)、黄曲霉毒素g1(afg2)、黄曲霉毒素g2(afg2)。afs可污染玉米、小麦、大豆和棉籽等谷物及油料农产品，亦可残留在一些ddgs、小麦麸、大豆粕和棉籽粕等农副产品中。当afs污染的农产品作为人的食品时，会危害人的健康，轻度的可致亚健康状况，严重可引起肝脏病变，导致死亡；而afs污染的农副产品饲喂动物时，常引起动物生产性能下降、抗病力降低，严重时会导致死亡等。因此，食品和饲料中afs的污染问题引起了世界许多国家政府和食品安全监测机构的重视，设定了食品和饲料中的afs限量标准。afs的科学研究也备受国内外学者的关注，在猪、奶牛和禽类等动物中开展了相应试验。
然而，国内报道的发酵培养基中afg2最高浓度仅为46ppb(冯建蕾，2004)，因此在开展afg2相关科学研究时，均需从国外进口价格昂贵(930rmb/mg)的afg2样品，试验成本高，或需要进行商品预订，给相关科学研究带来不便。综上所述，开发出afg2的发酵培养基及应用方法，可为动物的afg2毒理试验和afs的食品安全研究提供试验素材。
技术实现要素：
本发明提供了一种寄生曲霉的afg2产毒发酵方法，用于解决目前自然感染霉菌的谷物中afg2浓度低、不均匀、耗时长等问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种寄生曲霉的afg2产毒发酵方法，该方法包括如下步骤：
a、采用增菌培养基进行寄生曲霉孢子的复活增殖，所述的增菌培养基各组分按重量百分比计包括：25-30％马铃薯，10-15％葡萄糖，1-3％琼脂，3-5％酵母浸膏，0.4％复合矿物盐，0.3g/l青霉素，0.3g/l链霉素，余量为水；
b、采用固体发酵培养基进行固体发酵培养，所述的固体发酵培养基各组分按重量百分比计包括：40-70％早籼米，20-45％棉籽粕，6-12％蔗糖，0.2-0.5％复合矿物盐，3-5％酵母浸膏，按比例配制完后，调节固体发酵培养基含水量为15-20％；
增菌培养基和固体发酵培养基中所述复合矿物盐的组分以质量百分比计为：42-48％硝酸钠，10-16％硫酸镁，10-15％氯化钾，18-24％磷酸氢二钾，2.7-5.7％硫酸锌，2-5％硫酸锰，0.2-0.8％五水硫酸亚铁；将上述各矿物盐原料混合均匀，粉碎过80目分样筛后再次混合，得到复合矿物盐。
作为优选，所述寄生曲霉是中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)提供的寄生曲霉菌(aspergillusparasiticus)cgmccno.：3.0124。
作为优选，所述的早籼米和棉籽粕预先粉碎至粒度达到20-40目。
作为优选，所述的增菌培养基和固体发酵培养基，用盐酸或氢氧化钠调节ph值为5.5-7.0后，置于2l锥形瓶中，盖上棉塞，在121-123℃，0.12mpa的条件下进行灭菌20min。
作为优选，所述的增菌培养基中的氯霉素成分在灭菌结束后，待增菌培养基冷却至40℃以下后加入混匀。
发明人经大量的试验显示证明，利用本发明增菌培养基，在相同培养条件下，寄生曲霉孢子复苏所需的时间仅需2天，比传统培养基的复苏时间缩短4天，且孢子密度提高10倍。目前，在进行寄生曲霉增菌培养时，常规的培养基成分为：马铃薯、葡萄糖、琼脂和水，该培养基促寄生曲霉生长效率低，耗时长，易受杂菌污染，而本发明提供的增菌培养基效率明显提高。
优选的方案是，所述的固体发酵培养基各组分按重量百分比计包括：41.6-51.6％早籼米，37.9-44％棉籽粕，6-10.9％蔗糖，0.5％复合矿物盐，3-4％酵母浸膏。
进一步的，所述的早籼米和棉籽粕经粉碎，粒度达到20-40目标准。该固体发酵培养基所含碳水化合物(早籼米)、蛋白质(棉籽粕)、矿物质(复合矿物盐)和促生长因子(酵母浸膏)等营养物质恰好满足寄生曲霉高效产毒的条件，且比例适当，可实现寄生曲霉高效产afg2。在进行固体发酵培养时，现有技术所用的培养基仅为调节了水分的粉碎玉米，即普通的玉米，成分单一，营养成分不平衡，所需的发酵培养时间较长，本发明人也曾尝试采用单一的粉碎玉米培养基进行培养，效果也很差。现有技术采用的培养基中afg2浓度显著低于本发明的固体发酵培养基afg2浓度。
培养基的灭菌要求：所述的增菌培养基和固体发酵培养基，分别按比例配制好(其中，增菌培养基中的青霉素和链霉素成分在灭菌结束后，待增菌培养基冷却至40℃左右加入混匀)，用盐酸或氢氧化钠调节ph值为5.5-7.0后，置于2l锥形瓶中，盖上棉塞，在121-123℃，0.12mpa，灭菌20min，各培养基配制工作结束。
增菌培养基平板制作：在生物安全柜中，将灭菌好的增菌培养基倒置在经过灭菌的直径10cm培养皿中，自然冷却。然后，将增菌培养基放在37℃恒温箱中培养24h，无菌生长者方可使用。
本发明方法采用上述固体发酵培养基，发酵选用的菌种为寄生曲霉菌(来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmccno.3.0124)，发酵工艺采用常规的固体发酵工艺。按照本发明提供的培养基和培养方法，afg2在产毒培养基的固体风干物中浓度可达914ppb，相比现有技术的发酵效价，具有显著的进步。而且该方法发酵效率高，生产费用低，填补了我国afg2的生产领域的空白，并可极大降低afg2的毒理研究领域的研究成本。
本发明的有益效果是：本发明研制的增菌培养基，无细菌污染干扰，霉菌复活增殖快，孢子活力高，提高了工作效率。本发明研制的固体发酵培养基，营养均衡，霉菌生长旺盛，培养周期短，仅需12-13天，相对普通大米培养基，培养时间缩短5-7天，且afg2浓度显著提高。本发明提供的固体发酵培养基，主要采用早籼米、棉籽粕、蔗糖、复合矿物盐和酵母浸膏，原料易得、廉价。相对从国外进口的afg2，本发明提供的培养基生产出的afg2价格可降低80％以上。本发明提供的发酵方法，简单易行，可操作性强。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。
本发明的各实施例，以中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)提供的寄生曲霉菌(aspergillusparasiticus)cgmccno.：3.0124，进行阐述。
实施例1-4增菌培养基的配制
一种用于寄生曲霉菌菌种的增菌培养基，将表1所示的各组份混合后，用盐酸和氢氧化钠溶液调节增菌培养基ph值为5.5-7.0。
表1
实施例5-8复合矿物盐的准备
根据表2中的配比取硝酸钠、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钾、硫酸锌、硫酸锰和五水硫酸亚铁，将上述矿物盐混合均匀，粉碎过80目分样筛后，再次混合后备用，得到增菌培养基和固体发酵培养基中所述的复合矿物盐。
表2
现以实施例6的复合矿物盐配方和实施例2的增菌培养基配方为例，配制100g复合矿物盐和1l增菌培养基。
复合矿物盐(100g):分别用分析天平称取44.0g硝酸钠、14.0g硫酸镁、12.0g氯化钾，20.0g磷酸氢二钾，5.7g硫酸锌，4.0g硫酸锰，0.3g五水硫酸亚铁于烧杯混合均匀，然后将全部混合矿物盐放入高速离心机，粉碎10min,待全部样本通过80目分样筛后，再次混匀，放置在棕色瓶广口瓶中保留备用。
增菌培养基(1l)：先将马铃薯洗净去皮，再称取270g马铃薯切成小块，加800ml水煮沸20-30分钟，直至可被玻璃棒戳破，用4层纱布过滤至烧杯中，滤渣弃去，往烧杯中补水至1000ml，再往烧杯中加入120g葡萄糖，35g酵母浸膏，4g复合矿物盐，加热，再加入15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，使用5mol/l浓度的盐酸调节ph值于5.5-7.0。ph调节完毕，装入容量为2l的锥形瓶中，盖上棉塞，在121-123℃，0.12mpa，灭菌20min。
在生物安全柜中，往灭菌的40℃增菌培养基中加入青霉素和链霉素，使其在培养基中的浓度各自达到0.3g/l后，再倒置在已灭菌处理的直径10cm培养皿中，冷却后培养基即可凝固。然后，将增菌培养基放在37℃恒温培养箱中培养24h，无菌生长者方可使用，增菌培养基制备完毕。
用于寄生曲霉菌种保藏的斜面培养基的配制
按照寄生曲霉增菌培养基配方表，配制所需菌种保藏培养基。将配制好的增菌培养基，在培养基60℃未凝固状态下加入青霉素和链霉素，使其在培养基中的浓度各自达到0.3g/l，倒置在灭菌的试管中，体积约为试管容量的1/3，倾斜试管，自然冷却，即菌种保藏的斜面培养基制备完毕。
实施例9-12寄生曲霉固体发酵培养基的配制
按照表3的配方，配制所需固体发酵培养基。
表3
原料准备：将籼米和棉籽粕粉碎，要求能过20目标准分样筛，但不可过40目标准分样筛，即粒度介于20-40目。
现以实施例6的复合矿物盐配方和实施例10的组份为例，配制100g复合矿物盐和1l增菌培养基。
复合矿物盐(100g):分别用分析天平称取44.0g硝酸钠、14.0g硫酸镁、12.0g氯化钾，20.0g磷酸氢二钾，5.7g硫酸锌，4.0g硫酸锰，0.3g五水硫酸亚铁于烧杯混合均匀，然后将全部混合矿物盐放入高速离心机，粉碎10min,待全部样本通过80目分样筛后，再次混匀，放置在棕色瓶广口瓶中保留备用。
固体发酵培养基(1kg)。称取455g籼米，400g棉籽粕，100g蔗糖，5g复合矿物盐，40g酵母浸膏，另量取150ml蒸馏水，将上述原料混合均匀，置于3000ml锥形瓶中，盖上棉塞，在121-123℃，0.12mpa，灭菌30min。在生物安全柜中，将已灭菌的固体培养基倒置在已灭菌的三角烧瓶中，平铺厚度为1cm，或装载量为60g/500ml三角瓶，盖上已灭菌的瓶塞。至此，寄生曲霉发酵固体培养基配制完毕。
实施例13寄生曲霉的afg2产毒发酵培养
1、寄生曲霉菌种的增殖培养方法
菌种复活：在生物安全柜中，将安瓿瓶中保存的寄生曲霉冻干粉用0.5ml生理盐水溶解，然后用一次性无菌注射器吸取4ml溶解液，均匀点样于实施例2配制好的增菌培养基上，再用无菌玻璃棒将菌液涂抹分布均匀。将已接寄生曲霉的增菌培养基置于35℃恒温培养箱中培养44h，即可生长出大量的菌丝，达到试验要求，菌种复活完毕。
采用实例6复合矿物盐配方分别替代实施例1、3、4增菌培养基中复合矿物盐配方制得的增菌培养基，寄生曲霉复活所需时间分别为42h、48h和52h。
同样条件下，使用实施例5、7、8的复合矿物盐配方，分别替代实施例1增菌培养基中复合矿物盐配方，寄生曲霉复活所需时间分别为44h、48h和51h。
使用实施例5、7、8的复合矿物盐配方，分别替代实施例2增菌培养基中复合矿物盐配方，寄生曲霉复活所需时间分别为45h、44h和56h。
使用实施例5、7、8的复合矿物盐配方，分别替代实施例3增菌培养基中复合矿物盐配方，寄生曲霉复活所需时间分别为46h、49h和43h。
使用实施例5、7、8的复合矿物盐配方，分别替代实施例4增菌培养基种复合矿物盐配方，寄生曲霉复活所需时间分别为45h、42h和51h。
2、寄生曲霉菌种保存：在生物安全柜中，使用无菌接种针，灭菌冷却后，挑取上述溶解的菌液，在寄生曲霉菌种保藏的斜面培养基上呈z字型划线，盖上已灭菌的透气棉塞，然后置于35℃恒温培养箱中培养42h。待生长出较多的菌丝后，放置在4℃保鲜柜中保存，每两个月，按照本方法传代一次。
3、寄生曲霉菌在发酵培养基上发酵
寄生曲霉菌增殖培养：在生物安全柜中使用无菌接种环，用少许生理盐水冲洗上述已复活的寄生曲霉菌，并收集菌丝和孢子液，然后在多个增菌培养基上密集划线，置于35℃恒温培养箱中连续培养2d。长满菌丝的增菌培养基平板，可提供发酵所需的孢子和菌丝体。
寄生曲霉菌菌丝和孢子的收集：在生物安全柜中，用5ml无菌生理盐水冲洗增菌培养基平板，然后用无菌玻璃棒小心刮取菌丝，收集菌丝和孢子于已灭菌的250ml锥形瓶中，用无菌生理盐水稀释寄生曲霉菌液，直至孢子密度为1.2～1.4×106cfu/ml。
用一次性注射器吸取2ml寄生曲霉菌丝和孢子液，将菌液缓慢喷洒于实施例6配制好的固体培养基中，同时使用无菌玻璃棒混合均匀，盖上灭菌的透气棉塞，置于相对湿度85-90％，温度35℃的恒温培养箱中培养。
每天观察记录锥形瓶中寄生曲霉菌的发酵状态，以及培养箱运行情况。
每间隔3天，在生物安全柜中使用无菌玻璃棒将发酵培养基上下翻转，铺平发酵培养基,使培养基充分接触空气，同时喷洒5ml生理盐水，以补充发酵过程中水分的损失。盖上无菌棉塞，置于35℃恒温培养箱中继续培养。
经过10-12天的发酵培养，锥形瓶中培养基彻底发酵，培养基结块，菌丝颜色呈米黄色，发酵培养结束。将培养物于121-123℃，0.12mpa，灭菌20min，使用冷冻干燥机低压蒸发干燥、粉碎，含有afg2的培养物制备完毕。
用高效液相色谱法(gb/t5009.23-2006)检测发酵培养基中afg2的含量。采用实施例6复合矿物盐和实施例10的固体发酵培养基，发酵培养12d，风干样中afg2的浓度可达到914ppb。
采用实施例9、11、12的固体发酵培养基，在上述相同条件下进行发酵处理，风干培养基中afg2浓度分别为900ppb、910ppb和899ppb。
使用实施例5、7、8的复合矿物盐配方，分别替代实施例9的固体发酵培养基中复合矿物盐配方，在相同条件下发酵处理，风干样中afg2的浓度分别为908ppb、902ppb和789ppb。
使用实施例5、7、8的复合矿物盐配方，分别替代实施例10的固体发酵培养基中复合矿物盐配方，在相同条件下发酵处理，风干样中afg2的浓度分别为907ppb、910ppb和908ppb。
使用实施例5、7、8的复合矿物盐配方，分别替代实施例11的固体发酵培养基中复合矿物盐配方，在相同条件下发酵处理，风干样中afg2的浓度分别为902ppb、904ppb和872ppb。
使用实施例5、7、8的复合矿物盐配方，分别替代实施例12的固体发酵培养基中复合矿物盐配方，在相同条件下发酵处理，风干样中afg2的浓度分别为893ppb、876ppb和911ppb。
结论：现有技术的产毒浓度是46±3.6ppb，本发明afg2在产毒培养基的固体风干物中浓度可达914ppb，相比现有技术的46±3.6ppb，本发明afg2的产毒浓度发酵效价具有显著的进步。本发明方法发酵效率高，生产费用低，填补了我国afg2的生产领域的空白，并可极大降低afg2的毒理研究领域的研究成本。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。