一种检测、鉴定嗜酸乳杆菌NCFM的方法与流程

文档序号：13553462阅读：856来源：国知局

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测、鉴定嗜酸乳杆菌ncfm的方法。

背景技术：

嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)是乳杆菌属中应用较广泛的菌种之一，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，微好氧，化能有机营养类型，营养要求复杂，需要生长因子。其明显的特征是具有高度耐酸性，生长过程中释放乳酸，乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，对致病微生物具有拮抗作用。最适ph值为5.5～6.2，在ph5.0以下仍然可以生长。专性代谢糖类化合物，生成50％以上的乳酸。多分布于乳制品、发酵植物产品如泡菜、酸菜以及青贮饲料和人的肠道，尤其是乳儿肠道中。它们是许多恒温动物，包括人类口腔、胃肠和阴道的正常菌群。通常用于乳制品发酵、药品或益生菌制剂中。2011年11月2日卫生部网站公布了10月24日批准发布的《关于公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告》(2011年第25号公告)：公告批准公布了嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm为可用于婴幼儿食品的菌种之一。因此，提供一种新的检测、鉴定嗜酸乳杆菌ncfm的方法，非常有必要。

16srdna在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称，它既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列。因此，16srdna通常应用于细菌种属鉴定。pcr扩增片段的测序一般要从引物下游几十个bp以后，信号才逐渐稳定，因此pcr扩增的片段通常连入质粒载体，再利用载体上的测序引物进行测序，从而获得pcr扩增的全长序列。pcr扩增的16srdna通常利用大部分pcr产物3′端附有一个“a”碱基的taqdna聚合酶进行扩增，扩增产物直接连接到t载体，再利用t载体的测序引物进行测序。但taqdna聚合酶扩增的产物错配率较高。相对于taqdna聚合酶，高保真dna聚合酶扩增的产物错配率很低，但高保真dna聚合酶扩增的产物为平末端，不能直接用于ta克隆。

本申请提供的方法利用高保真dna聚合酶扩增得到的产物错配率降低的特点，能准确的初步鉴定嗜酸乳杆菌ncfm。

技术实现要素：

本发明的发明目的在于：本发明的目的是提供三组引物，利用这三组引物可使用高保真dna聚合酶扩增嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm16srdna并进行ta克隆，然后进行测序、比对、初步鉴定所测菌株是否为我国批准的可用于婴幼儿食品的菌种嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm，该方法具有较高的应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种检测、鉴定嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm的方法，具体步骤如下：

(1)提取待检细菌的基因组dna；

(2)以提取的细菌的基因组dna为模板，使用高保真dna聚合酶及引物进行pcr扩增，扩增产物经酶切、纯化后进行ta克隆；

(3)筛选ta克隆的阳性转化子，提质粒进行测序、比对，初步鉴定嗜酸乳杆菌ncfm；

所述引物的序列为：

plb16a:acgagactttgagtctggctcag，

mlb16a:accgacgctgcgtccacgtagttag,

plb16b:ttaactgggagagtttgatcctggctcag,

mlb16b:gtaactgggcggctgctggcacgtagttag,

plb16x:acgccagttttatcctggctcag，

mlb16x:tatccacgcgtctgctggcacgtagttag。

进一步说明，所述的高保真dna聚合酶为超保真dna聚合酶、超保真dna聚合酶、系列高保真dna聚合酶或platinum^tmpfxdna聚合酶。

进一步说明，所述扩增产物酶切步骤中具体操作是将扩增得到的pcr产物用ahdi、bmri、xcmi限制性内切酶进行酶切。

进一步说明，所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min，94℃循环变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终继续延伸10min。

进一步说明，ta克隆中t载体是pbackzero-tvector、pmd18-tvector、pmd19-tvector、pmd20-tvector、pgem-tvector、pgem-teasyvector、pgm-tvector、pgm-tfastvector、pgm-simple-tfastvector、pcr2.1-topovector、pcrii-topovector、pcr4-topovector、pcr8/gw/topovector、pslo-tvector或pslr-tvector。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)利用本发明的引物组及嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm基因组dna扩增得到的片段约为500bp，如果长度明显不符，可确定所测的菌株不是嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)。

(2)利用本发明的引物组及嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm基因组dna扩增得到的片段仅在引物上含有限制性内切酶ahdi、bmri、xcmi，扩增产物经ahdi、bmri、xcmi酶切后片段减少不明显，如扩增片段酶切后明显改变，可确定所测的菌株不是嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)。

(3)利用本发明的引物组，可使用高保真dna聚合酶pcr扩增嗜酸乳杆菌16srdna片段，酶切后可进行ta克隆；高保真dna聚合酶扩增的产物错配率低，连入t载体后用t载体上的测序引物进行测序，测序结果较全面、准确，经过比对，可初步鉴定菌种是否为嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm。

【附图说明】

图1是提取的基因组dna琼脂糖凝胶电泳图，

其中m是markeriii分子量标准，条带从上至下依次为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp；编号1是提取的基因组dna琼脂糖凝胶电泳图；

图2是扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图，

其中m是markeriii分子量标准，条带从上至下依次为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp；编号1是pcr扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是质粒用ecori/hindiii酶切电泳图，

其中m是markeriii分子量标准，条带从上至下依次为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp；编号1是质粒用ecori/hindiii酶切电泳图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

利用高保真dna聚合酶pcr扩增待检菌16srdna并进行ta克隆，测序后比对鉴定嗜酸乳杆菌ncfm。

(1)引物序列为：

plb16a:acgagactttgagtctggctcag(下划线为ahdi酶切位点)，

mlb16a:accgacgctgcgtccacgtagttag(下划线为ahdi酶切位点)，

plb16b:ttaactgggagagtttgatcctggctcag(下划线为bmri酶切位点),

mlb16b:gtaactgggcggctgctggcacgtagttag(下划线为bmri酶切位点)，

plb16x:acgccagttttatcctggctcag(下划线为xcmi酶切位点)，

mlb16x:tatccacgcgtctgctggcacgtagttag(下划线为xcmi酶切位点)；

引物委托金斯瑞生物科技公司合成。

(2)待检菌基因组dna的提取：

mrs肉汤培养：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉5.0g、酵母浸粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸三铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801.0g、ph值6.2±0.1、蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌15分钟,备用。

mrs固体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉8.0g、酵母浸粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温801.0g、琼脂14.0g、ph值6.5±0.2蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌15分钟,备用。

将待检样品液在mrs固体培养基上划线培养，挑单菌落在mrs肉汤培养，用细菌基因组dna提取试剂盒(天根)提取基因组dna，结果见图1。

(3)pcr扩增16srdna片段：

以提取的基因组dna为模板，用引物plb16a、mlb16a、plb16b、mlb16b、plb16x、mlb16x及产物为平末端、保真度优于taqdna聚合酶100倍以上的超保真dna聚合酶(neb)进行扩增，反应体系及条件如下：

反应体系设计为100ul总体系，具体是2×mastermix50ul，浓度为10mm的plb16a、mlb16a、plb16b、mlb16b、plb16x、mlb16x引物各0.7ul，dna模板2ul(约20ng)，用无菌水补足100ul体系。

反应条件为：94℃、5min预变性，循环内94℃、15s变性，55℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；pcr反应循环后72℃继续延伸10min。、

扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图见图2，从图中可见引物的特异性好,目的条带清楚,且无非特异性带产生,扩增的片段大小约为500bp，与理论一致。

(4)扩增产物进行ta克隆：

将扩增产物用dna纯化回收试剂盒(天根)进行琼脂糖凝胶回收纯化，回收的目的片段大小约为500bp，再用ahdi、bmri、xcmi(neb)酶切、纯化，得到的dna片段用pmd^tm19-tvectorcloningkit(takara)进行ta克隆。连接产物转化到感受态大肠杆菌jm109，涂布在筛选平板上，37℃过夜培养。

筛选平板为含100ug/mlamp的lb平板，其表面加40mlx-gal储液和4μliptg储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37℃下放置3-4小时，使培养基表面的液体完全被吸收。

筛选平板上的单菌落长到合适大小时，将平板置于4℃数小时,使显色完全。挑白色单菌落进行培养，提质粒，用ecori/hindiii酶切，得到约2.6kp与约0.5kp大小的条带，与理论大小一致(图3)。表明外源基因片段已连入t载体。

(5)测序，与嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm比对、鉴定：

用生物软件vectorntiadvance11.5将测序所得的序列与嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm基因组序列比对分析，根据比对结果进行菌种鉴定。

实施例2：

操作步骤与实施例1相同，不同点是使用超保真dna聚合酶(neb)替换超保真dna聚合酶。试验结果与实施例1相同。

实施例3：

操作步骤与实施例1相同，不同点是使用hsdna聚合酶(takara)替换超保真dna聚合酶。试验结果与实施例1相同。

实施例4：

操作步骤与实施例1相同，不同点是使用platinum^tmpfxdna聚合酶(thermofisher)替换超保真dna聚合酶。试验结果与实施例1相同。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所

<120>一种检测、鉴定嗜酸乳杆菌ncfm的方法

<130>2017

<141>2017-10-27

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna