一种汞的耐高盐核酸传感器及其应用的制作方法

本发明属于重金属检测技术领域，具体涉及一种汞的耐高盐核酸传感器及其应用。

背景技术：

汞是一种有巨毒的重金属元素，通常为银白色，是常温下唯一的液体金属，有流动性，常温下即可有蒸发，俗称“水银”。汞是地壳中相当稀少的一种元素，自然界中的汞主要以单质汞(hg)、无机汞(hg⁺、hg²⁺盐及其配合物)和有机汞(烷基汞、苯基汞)的形态存在，各种形态的汞在自然界中可以发生多种生物转化和化学转化。汞在自然中极少以纯金属的状态存在，硫化汞、氯硫汞矿、硫锑汞矿和与朱砂相关联的矿物是汞最常见的矿藏。汞能够通过水、空气、食物、药物、化妆品等多种途径污染，并持续存在于环境中且蓄积于食物链。

上个世纪五六十年代，日本水俣市和新泻市居民中流行水俣病即严重汞污染，是由于附近工厂排放物中含有高浓度的汞离子，在海洋中被甲基化成甲基汞，甲基汞通过食物链以高浓度聚集在水俣湾的鱼类和贝壳类体内，致使人食用以后，产生慢性甲基汞中毒。孕妇尤其要避免接触汞，因为甲基汞可以通过膜组织、胎盘屏障和血脑屏障破坏胎儿的中枢神经系统，对胎儿中枢神经的发育产生严重影响，造成婴儿的认知能力低下，甚至脑瘫。不仅如此，无机汞也会造成胎儿的损伤。胎儿早期低剂量摄入无机汞，汞依次蓄积于肝、肾、脑，损坏胎儿健康。职业人群，如混汞法炼金的金矿、汞矿开采冶炼、氯碱车间、温度计厂、金属冶炼车间的工人及牙科医生等，由于职业需要接触汞，汞蒸气易经呼吸道进入人体，在肺部吸收，经肺泡膜的扩散进入血液，快速送到全身组织器官，在中枢精神系统、肝及肾内蓄积使人体产生慢性汞中毒。汞中毒患者疼痛是职业病患者迫在眉捷、急需解决的问题。许多职业汞中毒患者会出现肌肉关节剧烈、长期、自发性、持续性、刺痛或深部烧灼痛。发作时病人常平卧、屈肘、屈膝、屈髓、全身肌肉紧张、剧痛难忍，常有大声哭叫、夜间痛甚、不能入眠等症状，另外，汞中毒症状还包括唾液增多，口腔點膜发炎，牙齿松动，牙周溃疡，恶心，呕吐，四肢麻瘦、震颤，体重减轻，食欲不振，精神抑郁消沉、小脑共济失调，语言、感觉、听力障碍等。汞中毒已经变为严重威胁人类健康的又一大隐患，因此，对于汞的检测与鉴定工作十分重要。

目前汞检测常用方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、原子突光光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电化学分析方法、原子吸收分光光度法等。虽然这些仪器分析方法在汞含量测定中有很多优点，例如灵敏度高、检测范围广、适合多种样品分析等。但毕竟存在着仪器昂贵、使用和维护成本高、耗时、样品预处理过程复杂且有些需要使用腐蚀性试剂、分析周期长、不适合一些缺乏精密仪器的现场分析等缺点，难以满足实际分析的要求。近些年来，利用有机染料、蛋白、dna、薄膜的化学传感器在汞检测分析方面有长足的发展，但也存在着水溶性、灵敏度、稳定性、选择性等各方面的不足。新型纳米材料应用于比色法，在很大程度上弥补了传统方法的不足。由于比色法操作简单、对仪器要求低，作为一种快速、有效检测汞的方法得到了发展。但是传统的比色检测汞方法仍有一定的局限性，例如操作步骤繁琐、灵敏度和选择性不佳、需使用的有机溶剂易对环境造成污染等，并且很多检测环境中有很高的盐弄浓度，往往会影响检测结果，因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足微量金属汞检测的需要。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题是，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供一种能够实现可视化检测、简便快速、高灵敏度和高特异性、耐高盐的汞的检测的功能核酸显色传感器。

本发明基于的基本原理为：汞离子可以和胸腺嘧啶形成(胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶，t-hg-t)的错配；有且只有汞离子存在时，才能形成等温指数放大反应(expar)的模板链，促发expar放大信号、并生成大量富含胸腺嘧啶的寡核苷酸序列，该序列在氯高铁血红素诱导下形成g-四链体结构，g-四链体结构发挥类辣根过氧化物酶(hrp)活性，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显色，硫酸终止反应后显黄色，通过手持式光谱检测仪就进行检测与定量。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供的一种汞的耐高盐核酸传感器，一种汞的耐高盐核酸传感器，包括分子识别和信号扩大元件和信号转化元件，

所述分子识别和信号扩大元件包括等温扩增体系；所述等温扩增体系包括a体系、b体系；

所述a体系包括：扩增模板、dntps、引物；

所述b体系包括：bstdna聚合酶和nt.bstnbi切刻内切酶；

所述分子识别和信号扩大元件识别汞离子，并将产生扩增产物

所述引物、扩增模板和扩增产物序列如下表：

其中扩增模板中gactc为nt.bstnbi切刻内切酶识别序列；

所述信号转化元件包括氯高铁血红素和显色剂。

上述传感器中，所述a体系还包括缓冲溶液，

上述传感器中，优选的，所述缓冲溶液为：0.1％牛血清白蛋白、0.2％甘油、300μg/ml海藻糖、ph7.4的溶液。

上述传感器中，所述b体系还包括聚合酶反应缓冲溶液和nt.bstnbi切刻内切酶反应缓冲溶液，

上述传感器中，优选的，所述聚合酶反应缓冲液：20mmtris-hcl,10mm(nh4)2so4,50mmkcl,2mmmgso4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，ph8.8；切刻内切酶反应缓冲液：100mmnacl,50mmtris-hcl,10mmmgcl2,300μg/ml海藻糖，ph7.9。

上述传感器中，所述信号转化元件还包括终止剂。

本发明同时提供了上述传感器在检测汞离子中的应用。

本发明还提供了一种检测汞离子的方法，包括步骤如下：

制备汞离子浓度和g-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；

进行待测样品的检测，得到待测样品的g-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算汞离子的浓度；

其中汞离子浓度和g-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：

(1)目标产物的等温扩增：

等温扩增体系由a体系、b体系组成；

所述a体系包括扩增模板、dntps、引物及缓冲溶液；

所述b体系包括bstdna聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、nt.bstnbi切刻内切酶和nt.bstnbi切刻内切酶反应缓冲溶液；

所述引物、扩增模板序列如下表：

其中扩增模板中gactc为nt.bstnbi切刻内切酶识别序列；

设置不同浓度的汞离子溶液分别与a体系混合，然后分别与b体系混合，得到一系列不同浓度的含有汞离子的扩增体系；进行等温扩增反应，得到一系列浓度的扩增产物；

(2)g-四链体结构显色物制备

将氯高铁血红素与上述一系列浓度的扩增产物分别进行反应，然后加入显色液后进行od值检测，得到od值随汞离子浓度变化的标准曲线。

上述方法中，所述待测样品的检测方法包括：将待测样品加入a体系中混合，然后与b体系混合进行等温扩增反应，得到待测样品的扩增产物；将待测样品的扩增产物与氯高铁血红素反应，然后加入显色剂进行od值检测。

上述方法中，所述等温扩增反应的步骤为：加入汞离子溶液的a体系在进行等温扩增反应前95℃孵育5min后，a体系和b体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应。

上述方法中，氯高铁血红素与扩增产物反应的方法为：将氯高铁血红素与扩增产物混匀后37℃反应30min，加入tmb显色剂，混匀，37℃反应10min，h2so4终止反应。

本发明还提供了一种检测汞离子的试剂盒，包括：等温扩增体系和显示体系，

所述等温扩增体系包括a体系、b体系和汞离子标准溶液，所述a体系包括扩增模板、dntps、引物及缓冲溶液；

所述b体系包括bstdna聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、nt.bstnbi切刻内切酶和nt.bstnbi切刻内切酶反应缓冲溶液；

所述引物、扩增模板序列如下表：

所述显示体系包括：氯高铁血红素和显色剂，所述显色剂为tmb显色剂。

上述试剂盒中，优选的，所述a体系包括：

1μm扩增模板母液：6μl，终浓度为0.2μm；

2.5mmdntps母液：3μl

1μm引物母液：6μl，终浓度为0.2μm

缓冲溶液：7.2μl

所述b体系包括：

8u/μlbstdna聚合酶母液：0.1μl，终浓度为0.02u/μl；

10倍量(10x)的聚合酶反应缓冲溶液：3μl，终浓度1倍量；

10u/μlnt.bstnbi切刻内切酶母液：1.2μl，终浓度0.37u/μl；

10倍量的切刻内切酶反应缓冲溶液：1.5μl，终浓度0.5倍量。

a体系中所述缓冲溶液为：0.1％牛血清白蛋白、0.2％甘油、300μg/ml海藻糖、ph7.4的溶液。

所述聚合酶反应缓冲液为：20mmtris-hcl,10mm(nh4)2so4,50mmkcl,2mmmgso4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，ph8.8。

所述切刻内切酶反应缓冲液为：100mmnacl,50mmtris-hcl,10mmmgcl2,300μg/ml海藻糖，ph7.9。

所述汞离子标准溶液为：2μl。可经1mm汞离子母液配置成不同的浓度。

所述显示体系包括：氯高铁血红素和显色剂，所述显色剂为tmb显色剂。

上述的“倍量”或“x”如无特殊限定，则为体积倍量。

上述的“终浓度”无特殊限定，则为物质混合后的在总的反应体系的浓度。如1μm扩增模板母液6μl，终浓度为0.2μm，指的扩增模板在等温扩增体系中的浓度。

本发明的有益效果

(1)本发明提供了一种基于核酸错配的汞离子的传感器和检测方法，其基于汞离子可以特异性的和胸腺嘧啶形成(胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶)的错配形成expar的模板链，从而发生等温指数放大反应(expar)，产生信号的一级放大和转化，反应产生的产物序列在血红素作用下，可以形成g-四链体，其具有催化活性，可以催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色，产生二级放大与转化，转化成可视化的信号，可以进行定性的判断。通过手持式光谱检测仪进行就可以进行定量检测通过两次的信号扩大和转化，本发明的传感器和具有很高的特异性和灵敏度，并且等温指数放大反应迅速，可以快速检测现场环境中的汞离子。

(2)本发明的传感器基于等温扩大反应设计了1条引物和1条模板链，就能达到特异性识别汞离子，并且具有较好的反应效果，简化了成本，提高了效率。

(3)本发明的传感器能够抵抗高盐浓度的干扰，在高盐环境中实现汞离子的检测，可以满足对高盐环境中的汞离子实现定性与定量分析，还能保持较高的特异性和灵敏度，能够检测痕量的汞离子。

附图说明

图1为不同浓度的汞离子作用下等温指数放大反应中扩增产物的变化图。

图2为od450值随汞离子浓度变化的标准曲线

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于此。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

实施例1引物的设计

根据汞离子可以特异性的和胸腺嘧啶形成(胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶)的错配形成expar的模板链，从而发生等温指数放大反应(expar)，来设计引物，得到序列如下：

注：扩增模板b中gactc为nt.bstnbi切刻内切酶识别序列，序列前四个碱基对处(c和a之间)即是合成链切割位点；引物和扩增产物都与扩增模板完全互补。

实施例2等温扩增反应

用于等温扩增反应的溶液由a体系和b体系组成。扩增反应体系组成：30μl体系。

a体系和汞离子溶液组成:24.2μl体系

扩增模板(1μm母液)：6μl(终浓度0.2μm)

dntps(2.5mm母液)：3μl

引物(1μm母液)：6μl，(终浓度0.2μm)

汞离子溶液(氯化汞溶解于1m的nacl溶液中)：2μl

缓冲溶液：7.2μl；

b体系组成：5.8μl；

bstdna聚合酶(8u/μl母液)：0.1μl(终浓度0.02u/μl)；

聚合酶反应缓冲溶液(10x母液):3μl(终浓度1x)；

nt.bstnbi切刻内切酶(10u/μl母液)：1.2μl(终浓度0.37u/μl)；

nt.bstnbi切刻内切酶反应缓冲溶液(10x母液):1.5μl(终浓度0.5x)；

a体系在进行等温扩增反应前95℃孵育5min后，a体系和b体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应。然后放入-20℃备用。

设置等温扩增体系中汞离子终浓度为1nm、10nm、100nm，使用real-timepcr仪进行信号检测，结果如图1所示。

实施例3g-四链体功能核酸显色传感器的制备

将80μl酶活缓冲液(100mmtris、120mmnacl、10mmmgcl2、100mmkcl，ph8.4)、10μl氯高铁血红素稀释溶液(2μl氯高铁血红素原液(10μm)与1ml酶活缓冲液(如上)混合)与10μl待显色物质(即扩增产物)混合，混匀后37℃反应30min，使扩增产物结合氯高铁血红素形成g-四链体结构，加入50μltmb显色液，混匀，37℃反应10min，加入汞离子的呈现绿色，加入50μl2mh2so4，混匀终止反应，呈黄色，酶标仪测定od450。由此完成信号转化。

实施例4检测汞离子的试剂盒

试剂盒包括等温扩增体系和显示体系，所述等温扩增体系包括a体系、b体系和汞离子标准溶液：

所述a体系包括：

1μm扩增模板母液：6μl，终浓度为0.2μm；

2.5mmdntps母液：3μl

1μm引物母液：6μl，终浓度为0.2μm

缓冲溶液：7.2μl

所述b体系包括：

8u/μlbstdna聚合酶母液：0.1μl，终浓度为0.02u/μl；

10倍量的聚合酶反应缓冲溶液：3μl，终浓度1倍量；

10u/μlnt.bstnbi切刻内切酶母液：1.2μl，终浓度0.37u/μl；

10倍量的切刻内切酶反应缓冲溶液：1.5μl，终浓度0.5倍量。

a体系中所述缓冲溶液为：0.1％牛血清白蛋白,0.2％甘油，300μg/ml海藻糖，ph7.4，即0.1％牛血清白蛋白、0.2％甘油、300μg/ml海藻糖、ph7.4的溶液。

所述聚合酶反应缓冲液为：20mmtris-hcl,10mm(nh4)2so4,50mmkcl,2mmmgso4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，ph8.8。

所述切刻内切酶反应缓冲液为：100mmnacl,50mmtris-hcl,10mmmgcl2,300μg/ml海藻糖，ph7.9。

所述汞离子标准溶液为：2μl，使用时可经1mm汞离子母液配置成不同的浓度。

所述显示体系包括：10μm氯高铁血红素溶液和tmb显色剂。

实施例5od450值随汞离子浓度变化的标准曲线的制备

配置不同浓度的氯化汞溶液(经1mm汞离子母液配置成不同的浓度；母液用1m的nacl溶液溶解，制备高盐环境)，分别加入根据实施例2制备的等温扩增反应体系中，最终形成30μl体系，即设置不同浓度的氯化汞扩增体系，其中汞离子的终浓度分别为1nm、2nm、10nm、30nm、50nm、70nm。

混匀后4摄氏度保存。之后根据实施例2的等温扩增反应方法与实施例3中g-四链体功能核酸显色传感器的制备的方法，得到不同汞离子浓度对应的od450，制备od450随汞离子浓度变化的标准曲线。结果如2所示，得到的标准曲线为：y＝0.012x+0.3021，r²＝0.998。

实施例6待测样品汞离子浓度的测定

在根据实施例2中的方法配置等温扩增反应体系中，加入待测样品，形成30μl体系。混匀后4摄氏度保存。之后根据实施例2的等温扩增反应方法与实施例3中显色方法，检测其od450值，其od450值为0.9676，带入标准曲线y＝0.012x+0.3021,得到汞离子浓度为x＝55.45nm。