胶质瘤诊断标志物Circ2:23823258|23823569及应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种用于胶质瘤诊断的血清circrna标志物circ2:23823258|23823569、以及检测该标志物的试剂用于制备胶质瘤诊断制剂的应用、还有试剂盒。
背景技术：
：脑胶质瘤是颅内最常见的恶性神经上皮细胞肿瘤，占颅内肿瘤的40.49％，是成人最常见的脑部肿瘤之一。从确诊开始，脑胶质瘤患者平均生存寿命不超过五年。目前胶质瘤的治疗技术多样，但由于肿瘤浸润侵袭速度快，以及对放化疗介导的细胞凋亡不敏感等特性，总体治疗效果不佳，复发率高，预后差，因此寻找新的治疗靶点和预后指标至关重要。目前胶质瘤诊断仍然处于以临床、病理学和影像学信息为基础的经验性阶段，而且一经诊断，绝大多数均为中晚期，术后生存率不容乐观。因此，寻找胶质瘤诊断标志物对高危人群进行筛查，并相应地选择合理的后续治疗方案，提高生存率，是神经科学领域亟待解决研究任务。circrna是一类不同于线性rna，广泛且多样地存在于哺乳动物细胞中的内源性封闭环状非编码rna分子，其结构稳定，不易受rna外切酶影响，能在转录，转录后，翻译等水平多层次调控基因表达，广泛存在于各类细胞中，脑部丰度极高。circrna近年来已成为非编码rna领域的新热点。随着深度测序技术的广泛应用和生物物理和信息学技术的快速发展，人们发现人类许多外显子的转录本可被非线性地反向剪接或通过基因重排而形成circrna，且它们在所有剪接转录本中占了相当大的比例，并具有丰富性、稳定性、高保守性和时空特异性等特征，有作为诸多疾病分子标志物的潜力。技术实现要素：本发明的第一个目的是：提供一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体circrna标志物。主要内容包括：一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体circrna标志物circ2:23823258|23823569，其序列如seqno:1所示。本发明的第二个目的是，提供检测所述的circrna标志物在血清外泌体中表达量的试剂在制备胶质瘤诊断制剂中的应用。本发明的第三个目的是，提供一种胶质瘤诊断试剂盒，其能够测定血清外泌体中的circ2:23823258|23823569的含量。所述的胶质瘤诊断试剂盒，含有检测circ2:23823258|23823569含量的pcr引物。优选引物的序列如seqno:2和3所示。所述的胶质瘤诊断试剂盒，除circ2:23823258|23823569的引物外，还含有从血清中提取外泌体、由外泌体中提取rna并进行逆转录及荧光定量pcr的所有试剂。包括：(1)提取血清外泌体所需试剂：totalexosomeisolationreagent(fromserum)，可由invitrogen公司购得，货号4478360；(2)提取外泌体rna所需试剂：trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；(3)逆转录所需试剂：随机引物(randomprimer)、无酶水、5×逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、rna酶抑制剂、mmlv逆转录酶；(4)荧光定量pcr所需试剂：circ2:23823258|23823569上下游引物、gapdh内参上下游引物、sybr染料、无酶水。本发明的有益效果在于：首次发现胶质瘤细胞所分泌的外泌体对circ2:23823258|23823569具有明显的富集作用，同时发现胶质瘤患者血清外泌体中circ2:23823258|23823569的表达水平相比于对照组明显升高(p<0.0001)，roc曲线分析显示其对胶质瘤具有较高诊断价值(auc＝0.811，p＝0.002，敏感度和特异度分别为66.7％和91.7％)。可见该环状rna对胶质瘤具有较高的诊断及预后分析价值；通过该环状rna在胶质瘤诊断分析中的应用，可以使得胶质瘤的诊断更加方便准确，为临床医生快速准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。附图说明图1为实时荧光定量pcr分析circ2:23823258|23823569在胶质瘤细胞与细胞所分泌的外泌体中的表达差异；图2为实时荧光定量pcr分析circ2:23823258|23823569在胶质瘤血清与正常血清外泌体中的表达差异；图3为roc分析血清外泌体来源的circ2:23823258|23823569对胶质瘤早期诊断的特异性，灵敏性。具体实施方式以下结合实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。一、研究对象1.两株胶质瘤细胞系为u251、u87细胞系，六株胶质瘤原代细胞分别为1104、1216、1125、1124b、1124c、0128c，均由中南大学基础医学院肿瘤研究所提供。2.40例胶质瘤患者的血清样本由湘雅医院提供，15例正常血清样本为同期进行社区疾病筛查的健康个体。用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一致。二、研究方法1.细胞、细胞所分泌的外泌体、胶质瘤/正常血清外泌体中rna的抽提a.细胞rna的抽提待上述八种细胞长至适当密度，倒掉培基，于培养皿中加入1mltrizol试剂，冰上裂解15分钟。裂解结束后移至1.5ml无酶tube管，4℃12000rpm离心10min，上清液移至新的tube管。加氯仿200μl/mltrizol于tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mltrizol混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000rpm离心10min；弃上清，加入75％depc水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500rpm离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入无酶水10μl溶解rna。-80℃保存备用。由实验员每天定时记录冰箱温度。b.细胞所分泌的外泌体中rna的抽提待上述八种细胞于培养皿养至适当密度(培养基内所用血清必须提前去除外泌体)，收集上清培养基约15ml于超滤管(millipore公司)，4500g于4℃离心1h。离心之后的超滤液收集于1.5ml无酶tube管，加入exoquick-tc试剂(sbi公司)后上下颠倒摇匀，4℃静止过夜沉淀。过夜后于常温1500g离心30min，弃掉上清，再次1500g离心5min，吸干上清液。沉淀即为细胞于培养基上清中所分泌的外泌体。将沉淀用1mltrizol试剂重悬，冰上裂解15分钟，裂解结束之后提取步骤同a。c.胶质瘤/正常血清外泌体中rna的抽提使用edta抗凝管采肘静脉血5ml，采血后轻轻摇动抗凝管使抗凝剂与血液混匀，4℃静置24小时后3000g常温离心5分钟。用微量移液器抽取200μl上层血清分装至新的600μl离心管中，-80℃保存备用。由实验员每天定时记录冰箱温度。取上述血清200μl于2000g常温离心30分钟，用微量移液器抽取上层清液至新的600μl离心管，加入40μl外泌体提取试剂(totalexosomeisolationreagent(fromserum)，货号4478360，invitrogen公司)轻轻上下颠倒摇匀，4℃孵育45分钟。孵育结束后10000g常温离心10分钟，弃掉上清液，所得沉淀即为血清中的外泌体。于沉淀中加入200μltrizol(mrc公司)使沉淀重悬，将悬液移至新的1.5mltube管，补trizol至1ml。冰上裂解15min，裂解结束之后提取步骤同a。2.cdna制备按照逆转录试剂盒(thermo公司)说明书进行逆转录反应。反应总体积为20μl(总rna10μl，randomprimer1μl,无酶水1μl，5×reactionbuffer4μl，ri1μl，rt1.00μl和10mmdntp2μl)。成分剂量/管随机逆转录引物(1μm)1μlrna样本10μl无酶水to12μl逆转录第一步条件：65℃5分钟逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。3.实时荧光定量pcr采用汉恒生物科技(上海)有限公司合成的特异性引物(引物序列见seqno：2和3)进行实时定量pcr：先将逆转录产物稀释10倍，混匀。20μl反应体系如下：成分剂量/管sybrpremixextaq10μl引物(10μm)0.5μlcdna产物5μl无酶水to20μl实时荧光定量pcr反应程序：95℃3分钟,40个循环，95℃10秒，60℃30秒。(6)数据分析：采用2-δct表示circ2:23823258|23823569相对于内参的表达倍数，其中△ct＝ct样本–ct内参。本实验数据采用相对定量的分析方法，gapdh作为内参基因(引物序列见seqno：4和5)，数据利用软件graphpadprism及spss进行分析。三、研究结果1.胶质瘤细胞所产生的外泌体中circ2:23823258|23823569相比于细胞内浓度明显升高，细胞外泌体对该环状rna具有良好的富集效果。具体结果如图1所示。2.通过15例正常人和40例脑胶质瘤患者血清外泌体的数据分析，胶质瘤患者的血清外泌体中circ2:23823258|23823569比正常血清外泌体对照组显著上调(p<0.0001)。具体数据如图2所示。roc曲线分析显示circ2:23823258|23823569作为生物标记物对胶质瘤具有较高诊断价值(auc＝0.811，p＝0.002，敏感度和特异度分别为66.7％和91.7％)，详细结果见图3。序列表<110>中南大学湘雅医院<120>胶质瘤诊断标志物circ2:23823258|23823569及应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>312<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>1gcuacuguggagccgauaucaaggcccugugcacugaagccgcccugauugcacugcgga60ggcguuauccccagaucuaugcuagcagucauaaacugcagcuggauguuuccucaauag120ugcuuagugcccaagauuuuuaccaugcaaugcagaauaucgugccugcuucccaacgug180cugugaugucuucagggcaugcacuaucccccaucauaagaccacugcuggaaagaagcu240ucaacaacauccuagcagucuugcaaaaaguguuuccucaugcugaaauuagccagagug300acaaaaaagaag312<210>2<211>20<212>dna<213>未知(unknown)<400>2ccatcataagaccactgctg20<210>3<211>22<212>dna<213>未知(unknown)<400>3gcactattgaggaaacatccag22<210>4<211>19<212>dna<213>未知(unknown)<400>4atcatcagcaatgcctcct19<210>5<211>18<212>dna<213>未知(unknown)<400>5catcacgccacagtttcc18当前第1页12