一种诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成破骨样细胞的方法与流程

本发明涉及细胞生物学及生物医药技术领域，具体涉及一种诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成破骨样细胞的方法。

背景技术：

我国是世界上老年人口最多的国家，其数量占到了世界老年人口总量的五分之一。按照国际标准，我国早已于1999年进入老龄化社会。随着老年人口数量的持续增加，特别是肥胖老年人口的增多，骨与关节退行性疾病人群剧增。据统计，65岁以上老年人骨关节疾病患病率高达80％-90％。骨与关节退行性病变得到了我国乃至全球医学界的广泛关注，然而，其临床治疗始终是个难题。目前，骨与关节退行性疾病已经成为老年人的常见病和多发病之一，成为继心脑血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤三大慢性病之后对人类威胁最广泛的疾病，严重危害到了老年人的健康和生活质量。骨与关节退行性病是以反复发作的关节疼痛和关节活动障碍为主的慢性退行性病变，其病理变化主要发生在活动关节，特别是负重关节的退行性疾患表现突出。在人体关节中，膝、髋关节除了支撑全身重量外，还要作多种活动，所以膝、髋关节退行性骨关节病最为常见。西医认为，骨与关节退行性变是多因性的疾病，与衰老、遗传、内分泌、肥胖、免疫和机械损伤等有关。然而，除了衰老和机械损伤是公认的危险因素外，其他致病因素尚无充分的实验依据。中医却对骨与关节退行性疾病有不同的理解，认为肾主骨、肝主筋，肝肾亏损则不能养骨荣筋。所以，中医认为骨与关节退行性疾病是因为肝肾虚亏、筋骨失养、长期劳损、气滞血瘀、风寒湿邪痹阻经脉所致。尽管如此，中、西医目前尚无法确切阐明骨与关节退行性疾病的直接原因。

骨是由细胞、细胞外基质和无机物组成的结缔组织，并通过骨组织细胞进行着骨塑建和重建过程。其中，成骨细胞、骨细胞和破骨细胞是构成骨组织代谢的基本功能细胞，成骨细胞能够促进骨的形成，而破骨细胞负责骨的吸收。当破骨细胞与成骨细胞作用失衡时就会引起骨与关节的病变。目前，国内外学者对成骨细胞与破骨细胞的形成分化有着极大的兴趣，破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成之间的平衡是维持正常骨重建基础。破骨细胞是体内唯一具有骨质吸收功能的多核巨细胞，骨吸收过程中破骨细胞的形成与活性异常可导致以骨质疏松为代表的骨与关节病变。

目前为止，还没有成熟的破骨细胞株，体外培养破骨细胞是研究破骨细胞特性的重要手段，由于直接分离破骨细胞数量少，存活时间短，不利于观察各种细胞因子对破骨细胞分化过程及活化的影响，自1981年testa等首次在体外骨髓造血细胞培养时发现有破骨细胞形成以来，骨髓源性细胞培养诱导分化破骨细胞技术逐渐开展并得到应用，目前对骨髓间充质干细胞(bmscs)和小鼠单核细胞raw264.7诱导分化成破骨细胞的研究报道居多。核因子κb受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor-κbligand，rankl)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolonystimulatingfactor，m-csf)是破骨细胞形成过程中的两种调控因子，国内外均已有关于这两种细胞因子单独或者联合使用诱导破骨细胞生成的报道，目前已成为体外获得破骨细胞的重要方法，但是作为细胞因子，rankl与m-csf的价格较为昂贵，这无疑限制了部分研究，也造成了破骨细胞体外培养的又一阻碍。1，25(oh)2d3在体内提高破骨细胞的活性，调节骨钙的沉积和释放，有相关报道称1，25(oh)2d3可促进破骨细胞的生成并具有剂量依赖性，但是目前研究报道1，25(oh)2d3联合rankl或m-csf作为一种破骨细胞培养体系的改良。体外培养破骨细胞，其数量少，体积大，需要刺激因子较多，成活率低，培养比较困难，限制了破骨细胞的深入研究。发现一种更优化的诱导方法等以期更快更多的获得破骨细胞，为研究破骨细胞及分化提供一个简便，实用，有效的方法。

一直以来很多研究退行性病的实验没有合适的动物模型，某些退行性病只得借用现有的动物模型，如研究神经退行性病变使用的是老年性痴呆的动物模型。用于研究骨关节病变的动物模型除了机械制动方式外，还有手术制备的方式、关节内注射、自发动物模型和转基因动物模型等。上述动物模型的诱发机制各不相同，帮助研究者了解骨与关节退行性病除了和年龄、负重因素有关外，还和激素水平、关节生物力学紊乱、骨密度等多种因素密切相关，但与骨与关节自然发生的退行性病变存在差异，骨与关节退行性病变的相关基因仍不明确，基因转入、表达的有效性及其调控机制仍不完善。目前，针对原因复杂的骨与关节退行性病变的动物模型，还没有在各个方面完全与人类骨与关节退行性变临床表现一致的，显然，单纯的关节注射也不能解决全身关节病变的问题。仿照人类退行性变生理状态制备骨与关节的疾病模型，受时间和动物状态等诸多因素的限制。用药物诱发导致动物多处骨和关节的退化甚至骨折，不但可以缩短研究的周期，也能为解决困扰老年人口疾患的普遍问题提供研究平台。

由于骨与关节病变的复杂性，目前仍缺乏很好药物筛选模型。目前的抗骨质疏松药物在很大程度上都存在许多不良反应：导致骨质脆性增高、颌骨坏死、高钙血症等不良反应，因此，继续研究疗效良好、安全性更高的药物具有重大意义。以成骨细胞和破骨细胞为模型进行抗骨质疏松药物的筛选和机理研究的报道也不断增多。根据成骨细胞、破骨细胞在骨形成中的作用，建立成骨细胞、破骨细胞模型，通过研究药物对其分化、成熟及功能的影响，有望成为开发骨质疏松症治疗药物的重要手段之一。

硫代乙酰胺(thioacetamide，taa)皮下注射制备兔肝纤维化动物模型时发现，随着用药时间的延长，实验组动物逐渐出现关节水肿、充血、股骨头坏死甚至负重骨骨折的现象。taa是急、慢性肝损伤/肝纤维化常用的致毒剂，然而，早在1984年，日本学者lassilav就发现了taa诱发的肝损伤伴有血清蛋白和牙槽骨的变化。1996年，nakanoa等用四氯化碳(ccl4)和taa制备肝硬化模型时也提出，taa会造成肝性骨营养不良。2013年，kadirfa还发现，taa可以引起肾脏的损害。这似乎印证了中医关于肝肾亏虚导致筋骨失养的理论。随着对taa研究的不断深入，课题组发现，日常生活中人们可以通过接触电镀添加剂、照相药品、农药以及染色助剂等接触到taa。无独有偶，南京市代谢性骨病防治研究中心林华主任接诊了因染发引起的9例骨质疏松患者，最严重的2例甚至出现了股骨头坏死。体检显示，9位患者中没有雌激素水平下降、糖尿病、内分泌等疾病，可是这些患者都有一个共同点，就是在出现骨质疏松的半年内曾经染发。而且，对患者采取了剃光所染头发的紧急处理措施后，这些患者的病情不再继续发展。更有甚者，有报道称美发师夫妇生下了畸形海豹儿，巧合的是，齐玉娟等人也发现，taa不但损伤斑马鱼的肝脏，还会引起幼鱼体型畸变。综合上述案例，我们有理由猜想：taa除了引起肝、肾损害外，还具有破坏骨质的作用；染发可能是导致骨质疏松、引起骨与关节损害的一大新诱因，染发助剂中的硫代乙酰胺可能就是罪魁祸首。

taa具有一定的肝毒性，根据以往报道可以发现taa与骨质损伤也存在因果关系，原因尚无报道。将taa作为破骨样细胞生成的诱导剂是个大胆的尝试，也是极具创新的想法。可以想象，taa作为诱导剂具有细胞因子不能媲美的优点，作为生活中较常使用的一种化学药品，其价格低廉，容易生产，而且使用方便；taa也将成为建立骨质疏松动物模型和药物筛选模型的合适药物，这无疑是骨与关节病变研究的重大突破。

技术实现要素：

本发明的目的是利用硫代乙酰胺诱导骨髓间充质干细胞分化为破骨样细胞，建立一种新型体外破骨细胞培养体系，与现有诱导分化生成破骨样细胞的方法比较，所用的硫代乙酰胺价格低廉，容易生产，使用方便。

本发明的实现过程如下：

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

筛选合适的硫代乙酰胺使用剂量进行诱导实验

硫代乙酰胺诱导骨髓间充质干细胞向破骨样细胞分化

诱导分化获得的破骨样细胞的鉴定

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1、本发明所用硫代乙酰胺(ch3csnh2)是一种生活中较常用的化学品，一种晶状体，易储存，其水溶液在室温相当稳定，使用方便，与rankl和m-csf这两种细胞因子相比，其价格低廉，容易生产，使研究成本大大降低。

2、本发明利用硫代乙酰胺诱导产生的破骨样细胞数量较多，所用时间短，适用于基础研究。

3、本发明在细胞水平证实硫代乙酰胺可以诱导骨髓间充质干细胞分化成破骨样细胞，而与rankl和m-csf相比硫代乙酰胺更适合用于建立骨与关节病变细胞模型和药物筛选模型。同时这可能暗示taa进入体内对骨质具有较强的损伤作用，应得到人们的警惕。

4、附图说明

图1大鼠骨髓间充质干细胞培养图

生长状态良好的第3代大鼠骨髓间充质干细胞：新鲜获取的间充质干细胞贴壁生长，大小不一，随着细胞的增值，融合，大部分细胞呈现多角形或星状形态。

图2流式细胞术对大鼠骨髓间充质干细胞鉴定图

a)骨髓间充质干细胞表面标志物cd90呈阳性表达，表达率为99.69％

b)骨髓间充质干细胞表面标志物cd29呈阳性表达，表达率为99.87％

c)骨髓间充质干细胞表面标志物cd45呈阴性表达，表达率为4.77％

d)骨髓间充质干细胞表面标志物cd11b/c呈阴性表达，表达率为5.17％

图3cck-8法测定硫代乙酰胺对骨髓间充质干细胞的毒性作用生长曲线图

0.5，1，1.5，2mg/ml的硫代乙酰胺(taa)处理大鼠骨髓间充质干细胞12h、24h、48h、60h、72h、80h、96h后的细胞抑制率曲线图：cck-8结果显示，细胞抑制率随着加药时间和剂量的增加而增加，时间加药时间达72小时时，细胞抑制率达到平台期。当加药时间达24h时，taa浓度为0.5mg/ml和1mg/ml时，细胞抑制率已上升至50％左右，因此，我们选择0.5mg/ml和1mg/ml作为后续实验taa的诱导浓度。

图4抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色法鉴定诱导分化获得的破骨样细胞图

taa(0.5mg/ml和1mg/ml)诱导骨髓间充质干细胞3和7天后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色(trap)法鉴定诱导分化获得的破骨样细胞：trap染色结果显示，与对照组相比，加药诱导组可以观察到更多的trap染色阳性细胞，即破骨样细胞。加药后细胞体积更大，可看到多于3个细胞核的细胞，加药浓度为1mg/ml比0.5mg/ml组可观察到更多阳性细胞。

图5westernblot法鉴定诱导分化获得的破骨样细胞图

taa(0.5mg/ml和1mg/ml)诱导骨髓间充质干细胞3和7天后，检测抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)、组织蛋白酶k(cathepsink)的蛋白表达：结果显示，加药组3天和7天后，蛋白trap和cathepsink的表达明显上升，加药浓度为1mg/ml比0.5mg/ml上升趋势更加明显。破骨细胞特异性蛋白水平呈上升趋势，说明破骨细胞生成量增加。

图6电化学发光法检测骨代谢标志物水平图

taa(0.5mg/ml和1mg/ml)诱导骨髓间充质干细胞3和7天后，检测n端骨钙素(ng/ml)，甲状旁腺激素(pg/ml)，维生素d(ng/ml)。a和b为诱导3天后检测所得数据；c和d为诱导7天后检测所得数据：结果显示，加药3天后，与对照组相比，加药组(1mg/ml)的骨钙素水平明显上升；加药组(1mg/ml)的维生素d明显下降；甲状旁腺激素在0.5mg/ml和1mg/ml两组都明显上升。加药7天后，与对照组相比，骨钙素与甲状旁腺激素在0.5和1mg/ml两组都明显上升(骨钙素p＜0.05，甲状旁腺激素p＜0.01)；维生素d在1mg/ml组明显下降。以上溶骨相关和骨转换相关骨标志物水平的变化说明破骨细胞活性增强。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明的硫代乙酰胺诱导骨髓间充质干细胞向破骨样细胞分化作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1大鼠骨髓间充质干细胞分离培养鉴定

一、大鼠骨髓间充质干细胞(bmscs)的分离与培养

大鼠乳鼠麻醉处死后，体积分数75％乙醇浸泡15min后剥离双下肢，无菌条件下分离出双下肢股骨。pbs漂洗，剪断股骨骨垢端，用含体积分数10％胎牛血清的dmem/f12培养液冲洗骨髓腔，收集单细胞悬液，1000r·min^-1离心7min，弃上清液，用10％胎牛血清的dmem/f12培养液重悬，取约5×10³个细胞接种在25cm培养瓶中，置于37℃、体积分数5％co2的培养箱中培养，48h后首次全量换液，以后每2～3d换液，10～12d后细胞融合70％～80％，0.25％胰酶消化后以1∶3传代培养。

二、大鼠骨髓间充质干细胞(bmscs)的鉴定

取生长状态良好的第3代bmscs，0.25％胰酶消化，1500r·min^-1、25℃离心7min，弃上清，pbs制成单细胞悬液，计数细胞，以1×10⁶个细胞分装流式管，各管依据说明书依次加入相应剂量cd90、cd29、cd45、cd11b/c单克隆抗体(抗大鼠)，同时设立同型阴性对照，充分混匀，4℃孵育1h，离心弃上清，pbs清洗3次，pbs重悬细胞后流式细胞仪检测分析。

实施例2cck-8法筛选硫代乙酰胺诱导剂量

取生长状态良好的第3代bmscs，0.25％胰酶消化，制成单细胞悬液，计数，取约3×10³个/孔，接种在96孔板，96孔板移入37℃、体积分数5％co2的培养箱中，培养24小时后，更换为含有浓度为0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml的硫代乙酰胺(taa)的培养液，在12h、24h、48h、60h、72h、80h、96h时用酶标仪570nm波长检测各孔光吸收值，记录各孔结果，每孔平行测定3次，结果取平均数，以横轴为时间、纵轴为光吸收值绘制生长曲线，并计算细胞抑制率：

细胞抑制率(％)＝(对照组od值-实验组od)/对照组od值×100％

实施例3硫代乙酰胺诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成破骨样细胞

取第3代大鼠bmscs培养板或培养皿中，当bmscs达50%～60％融合时，将培养基更换为含相应剂量taa(0.5mg/ml和1mg/ml)的培养液，每3天更换一次培养液，在第3天和第7天时分别进行破骨样细胞鉴定。

实施例4硫代乙酰胺诱导的破骨样细胞鉴定

一、抗酒石酸酸性磷酸酶染色(trap)鉴定破骨样细胞

取第3代大鼠bmscs以每孔2×10³接种于96孔培养板，当培养的bmscs达50％～60％融合时，将培养基更换为含相应剂量taa(0，0.5，1mg/ml)的培养液，作用时间分别3天和7天后，取出96孔板内已完成诱导分化的细胞，弃孔内培养基，37℃预热pbs洗2次，每孔加入200μl4％多聚甲醛固定液，室温固定30min，双蒸水洗涤2次，室温下干燥至少15min，按照染色试剂盒操作说明书配制trap染色，每孔加入500μltrap染色液(37℃恒温箱提前预热)，37℃避光染色1h，双蒸水洗2次，苏木素染核2～5min，双蒸水洗涤2次，室温干燥，拍照。

二、westernblot法检测taa对抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)和组织蛋白酶k(cathepsink)蛋白表达影响

将上述各组细胞提取蛋白与5×蛋白上样缓冲液以4∶1混匀，100℃煮沸5min变性蛋白，每孔上样10-20μl的蛋白样品(蛋白浓度为20-40μg)进行sds-page电泳。电泳结束后，转膜至pvdf膜经一抗个二抗孵育后，ecl显色液显影2min，用化学发光自显影进行显色曝光。凝胶成像系统采集与分析蛋白条带灰度值，目的蛋白表达量以内参β-actin进行标准化，对比分析各实验组间蛋白表达的差异情况。

三、电化学发光法检测骨代谢标志物n端骨钙素(ng/ml)，甲状旁腺激素(pg/ml)，维生素d(ng/ml)

取第3代大鼠bmscs细胞以每孔2×10⁵接种于6cm²中，培养24h后，分别加入相应剂量taa(0，0.5，1mg/ml)，作用时间3天和7天后，吸取细胞培养液于5ml离心管中，1000r·min-¹，室温离心5min，取上清上机检测。