本发明属于菌种检测领域，具体涉及一种双孢蘑菇栽培种污染源和环境洁净度的监测方法。
背景技术：
双孢蘑菇(agaricusbisporus)属担子菌门、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属、又称蘑菇、白蘑菇、洋蘑菇为中低温结实性草腐菌，我国稻草、麦草丰富，气候比较适合双孢菇的生长，具有很大发展潜力。很多国家都有栽培，其中我国总产占第二位，蘑菇罐头在国际贸易量中占首位。双孢菇的菌肉肥嫩，并含有较多的甘露糖、海藻糖及各种氨基酸类物质，所以味道鲜美，营养比一般蔬菜高，有"植物肉"之称。
菌种是食用菌生产之源头，菌种的纯度直接影响食用菌的生长和产量。在食用菌生产过程中，由于灭菌不彻底，或接种、培养和保存环节不慎，往往会携带、污染其他真菌、细菌等杂菌。在双孢蘑菇生产上，不但要求菌种不被污染，而且要做到一定时间内保持菌种生命力及原始种优良性状。但在制种过程中，往往由于营养、温度、水分、空气相对湿度和空气中沉降菌等环境条件不适宜，引起菌种老化、退化和变异。菌种质量问题引进菌种本身种性已退化，或制种技术欠缺或由于菌种多次传代等，均可引致菌种原本优良性状退化，表现为：接种后萌发慢、菌丝弱、发菌慢、抗逆性差或出菇少，严重者病害肆虐，导致生产失败。因此找寻一个简单的检测方式来找寻菌种污染源，检测环境的洁净度，指导工厂化生产双孢蘑菇菌种的生产显得非常有意义。
技术实现要素：
本发明的目的是，针对目前双孢蘑菇工厂化生产过程中容易被杂菌污染，而污染源的找寻缺乏有效快速的方法，提出一种工厂化双孢蘑菇栽培种污染源的简便的检测方法，同时针对空气潜在的沉降菌对双孢蘑菇栽培种生长的影响，提出一种工厂化生产双孢蘑菇的简单有效的环境洁净度的检测方法。
本发明所采用的技术方案是：一种工厂化生产双孢蘑菇栽培种污染源和环境洁净度的监测方法，具体步骤如下：
1、制作马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基用于真菌的检测培养：脱皮马铃薯200g，加入适量的蒸馏水煮熟(熟而不烂)后滤出滤液，加入葡萄糖20g、琼脂20g，加入蒸馏水到1l，电磁炉加热搅拌至充分溶解，高压蒸汽122℃，灭菌30min，超净工作台中冷却至大约50℃倒大约45支90mm平板。
2、制作肉汤琼脂(ec)培养基用于细菌的检测培养：ec肉汤培养基粉末37g，加入琼脂20g，加入蒸馏水到1l，电磁炉加热搅拌至充分溶解，高压蒸汽122℃，灭菌30min，超净工作台中冷却至大约50℃倒大约45支90mm平板。
3、采集沉降菌：用检测pda培养基和ec培养基在主要环境监测点采集沉降菌，其中主要环境监测点为①操作台②封口机③原种④培养袋⑤培养基⑥手套⑦净化服⑧百级区；
①操作台检测：接种操作前打开检测培养皿放在接种操作台一侧，直到接种操作完成密封并编号为1号培养皿。
②封口机检测：接种操作前打开检测培养皿放在封口机上方检测封口机上方空气，直到接种操作完成密封并编号为2号培养皿。
③原种检测：接种操作前用酒精喷洒原种瓶外壁并用酒精棉擦拭瓶壁、接种勺，打开检测培养皿用接种勺取少许原种放入检测培养皿并密封编号为3号培养皿。
④培养袋检测：接种操作前用酒精喷洒培养袋并用酒精棉擦拭培养袋外包装口用开口剪剪开外包装，打开检测培养皿深入包装袋内检测培养袋包装环境然后密封并编号为4号培养皿。
⑤培养基检测：接种操作前用酒精喷洒灭菌袋口并打开灭菌袋用检测培养皿取少许培养基然后密封并编号为5号培养皿。
⑥手套检测：接种操作前打开检测培养皿手指平伸放入接触检测培养皿完成后密封并编号为6号培养皿。
⑦净化服检测：接种操作前打开检测培养皿并与净化服移动接触完成后密封并编号为7号培养皿。
⑧百级区检测：接种操作开始前打开检测培养基皿盖放在百级捏袋区域，静置30min后密封并编号为8号培养皿。
4、培养潜在杂菌污染：用检测pda培养基和ec培养基在主要环境监测点采集沉降菌后分别在24℃和36℃培养箱内对真菌和细菌进行48h培养；
5、污染源分析：对pda培养基和ec培养基中的菌落进行观察记录，同时对双孢蘑菇栽培种培养过程中的污染情况进行监测，将菌种培养过程中出现的污染情况与不同监测点采样的检测培养基上菌落形态进行比对，根据杂菌污染种类的异同找出污染源。
6、环境洁净度分析：以百级区检测培养基上的菌落计数为依据对环境的洁净度进行监测，当检测pda培养基和ec培养基上的真菌和细菌菌落数和大于1时，环境洁净度不达标。
本发明制备方法的有益效果是：
1、能够直观简单的得到双孢蘑菇菌种污染源，进而指导生产；
2、采用培养基计数菌落的方式跟直观简单的得到环境洁净度的检测和控制方法，更好的培育双孢菇的菌种，得到产量高品质优的双孢蘑菇；
3、本发明方法操作简单，成本低，能够更加直观灵活检测菌种生产车间的洁净度，并且能够更加快捷的排查污染源，以便改进操作，降低污染率。
具体实施方式
为了更充公解释本发明的实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
制作马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基用于真菌的检测培养：脱皮马铃薯200g，加入适量的蒸馏水煮熟(熟而不烂)后滤出滤液，加入葡萄糖20g、琼脂20g，加入蒸馏水到1l，电磁炉加热搅拌至充分溶解，高压蒸汽122℃，灭菌30min，超净工作台中冷却至大约50℃倒大约45支90mm平板；
制作肉汤琼脂(ec)培养基用于细菌的检测培养：ec肉汤培养基粉末37g，加入琼脂20g，加入蒸馏水到1l，电磁炉加热搅拌至充分溶解，高压蒸汽122℃，灭菌30min，超净工作台中冷却至大约50℃倒大约45支90mm平板；
采集潜在杂菌污染：用检测pda培养基和ec培养基在主要环境监测点采集潜在杂菌污染：①操作台检测：接种操作前打开检测培养皿放在接种操作台一侧，直到接种操作完成密封并编号为1号培养皿。②封口机检测：接种操作前打开检测培养皿放在封口机上方检测封口机上方空气，直到接种操作完成密封并编号为2号培养皿。③原种检测：接种操作前用酒精喷洒原种瓶外壁并用酒精棉擦拭瓶壁、接种勺，打开检测培养皿用接种勺取少许原种放入检测培养皿并密封编号为3号培养皿。④培养袋检测：接种操作前用酒精喷洒培养袋并用酒精棉擦拭培养袋外包装口用开口剪剪开外包装，打开检测培养皿深入包装袋内检测培养袋包装环境然后密封并编号为4号培养皿。⑤培养基检测：接种操作前用酒精喷洒灭菌袋口并打开灭菌袋用检测培养皿取少许培养基然后密封并编号为5号培养皿。⑥手套检测：接种操作前打开检测培养皿手指平伸放入接触检测培养皿完成后密封并编号为6号培养皿。⑦净化服检测：接种操作前打开检测培养皿并与净化服移动接触完成后密封并编号为7号培养皿。⑧百级区检测：接种操作开始前打开检测培养基皿盖放在百级捏袋区域，静置30min后密封并编号为8号培养皿。
培养潜在杂菌污染：用检测pda培养基和ec培养基在主要环境监测点采集潜在杂菌污染后分别在24℃和36℃培养箱内对真菌和细菌进行48h培养；
污染源分析：对pda培养基和ec培养基中的菌落进行观察记录，净化服相对应的检测pda培养基上出现圆形的绿色绿霉菌落形态污染，同时双孢蘑菇栽培种培养袋中出现较大面积绿色霉菌，判定双孢蘑菇栽培中的绿霉污染源为净化服。
环境洁净度分析：观察8号培养皿，检测pda培养基和ec培养基上的真菌和细菌菌落数为0.5，小于1，环境洁净度达标。
实施例2：
制作马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基用于真菌的检测培养：脱皮马铃薯200g，加入适量的蒸馏水煮熟(熟而不烂)后滤出滤液，加入葡萄糖20g、琼脂20g，加入蒸馏水到1l，电磁炉加热搅拌至充分溶解，高压蒸汽122℃，灭菌30min，超净工作台中冷却至大约50℃倒大约45支90mm平板；
制作肉汤琼脂(ec)培养基用于细菌的检测培养：ec肉汤培养基粉末37g，加入琼脂20g，加入蒸馏水到1l，电磁炉加热搅拌至充分溶解，高压蒸汽122℃，灭菌30min，超净工作台中冷却至大约50℃倒大约45支90mm平板；
采集潜在杂菌污染：用检测pda培养基和ec培养基在主要环境监测点采集潜在杂菌污染：①操作台检测：接种操作前打开检测培养皿放在接种操作台一侧，直到接种操作完成密封并编号为1号培养皿。②封口机检测：接种操作前打开检测培养皿放在封口机上方检测封口机上方空气，直到接种操作完成密封并编号为2号培养皿。③原种检测：接种操作前用酒精喷洒原种瓶外壁并用酒精棉擦拭瓶壁、接种勺，打开检测培养皿用接种勺取少许原种放入检测培养皿并密封编号为3号培养皿。④培养袋检测：接种操作前用酒精喷洒培养袋并用酒精棉擦拭培养袋外包装口用开口剪剪开外包装，打开检测培养皿深入包装袋内检测培养袋包装环境然后密封并编号为4号培养皿。⑤培养基检测：接种操作前用酒精喷洒灭菌袋口并打开灭菌袋用检测培养皿取少许培养基然后密封并编号为5号培养皿。⑥手套检测：接种操作前打开检测培养皿手指平伸放入接触检测培养皿完成后密封并编号为6号培养皿。⑦净化服检测：接种操作前打开检测培养皿并与净化服移动接触完成后密封并编号为7号培养皿。⑧百级区检测：接种操作前30min打开检测培养皿放在百级捏袋区域，接种操作开始时密封并编号为8号培养皿。
培养潜在杂菌污染：用检测pda培养基和ec培养基在主要环境监测点采集潜在杂菌污染后分别在24℃和36℃培养箱内对真菌和细菌进行48h培养；
污染源分析：对pda培养基和ec培养基中的菌落进行观察记录，手套相对应的检测pda培养基上出现乳黄色或白色或粉色的类似浆糊状的物质，附着在基质表面，同时双孢蘑菇栽培袋中出现菌丝生长异常，并且麦粒表面附着一层浆糊状的粘液，判定双孢蘑菇栽培种的酵母菌污染源为手套。
环境洁净度分析：观察8号培养皿，检测pda培养基和ec培养基上的真菌和细菌菌落数和为2，大于1，环境洁净度不达标，对净化室的空气净化系统和除菌系统进行排查、改善，使生产正常进行。