东亚砂藓水通道蛋白RjPJPIP2‑1基因及其编码蛋白和应用的制作方法

本发明涉及一种基因及其编码蛋白和应用，尤其涉及东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因及其编码蛋白和应用。

背景技术：

水资源缺乏严重影响了全球农业的发展，干旱引起的粮食欠缺，土地沙漠化，及生态环境的破坏等灾害更应得到人们的重视。因此，通过开发抗旱基因资源，利用现代分子水平及蛋白水平等生物技术研究植物的抗逆机理，培育出抗旱、抗盐、抗寒等优良植物新种，用以加强恶略环境中农作物的适应能力，增加植物在水资源匮乏时的抵抗能力，促进经济作物、环境绿化植物的良好生长，将成为人们研究的重要课题。

水通道蛋白(aquaporins)，别名水孔蛋白，简称aqps，普遍定位于真核及原核细胞的细胞膜上，主要的功能是细胞内外水份的运输。水通道蛋白主要由40％的α螺旋与42％的β折叠及转角组成，根据其序列的二级拓扑学和三维结构分析，水通道蛋白在生物体内以四聚体的形式存在。一部分学者认为水通道蛋白的单体形式及二聚体形式就具有水份转运的能力，但大量试验发现生物中多数的水通道蛋白是以四聚体的形式存在，主要分析原因为四聚体的形式对折叠的蛋白质的稳定构成以及膜上该蛋白的位置和特殊功能上都起着重要的作用。迄今为止，已对多种植物中的aqps进行了克隆。其中最早开始进行试验的水通道蛋白基因的谷物为玉米，发现存在36种水通道蛋白基因的相似物；拟南芥鉴定含有35种aqps基因；水稻中发现了38个aqps基因；小麦通过测序有35个aqps基因。通过蛋白分析的数据库可以看出，许多植物的维管束鞘细胞中不存在叶绿体的c3植物以及含有无基粒叶绿体的c4植物，单、双子叶中都含有相似性较高的水通道蛋白氨基酸。水通道蛋白可分为7类，其中以pip最受关注，研究较多。研究发现，在水稻、玉米、拟南芥等植物中，水通道蛋白与细胞膜的透水能力、干旱条件下生理生化现象密切相关。

苔藓植物是最古老的由水生向陆生过渡的植物类群，现存的种类数量仅次于被子植物，广泛分布于世界各地。苔藓植物对逆境环境有很强的适应性，可在干旱、高温等极端气候中生存。苔藓植物结构相对简单，配子体为单倍体，对基因水平上研究其耐性提供了极大的便利。东亚砂藓(racomitriumjaponicum)属紫萼藓科(grimmiaceae)砂藓属(racomitrium)，植物体挺硬，有时粗壮，常呈疏松成片丛生，存在于岩石表面、石壁边缘的土层及沙土中。其最主要的特点是具有极强的抗旱性，可以在干旱环境中存放数年，复水后立刻恢复正常生长。因此，从东亚砂藓中克隆与抗旱相关的基因，初步研究其潜在的生物学功能，可为深入研究该基因的抗旱相关机理和苔藓植物的耐旱机制提供理论依据，具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因及其编码蛋白和应用。

本发明东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示。

本发明编码东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示。

本发明东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因的应用是指在提高植物抗旱性上的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供的东亚砂藓水通道蛋白基因来自东亚砂藓。以东亚砂藓为实验材料，克隆出与抗旱相关的水通道蛋白基因，并进行转基因，已获得转基因植株，可为植物基因工程育种提供优良基因资源，同时为改良植物的抗逆性提供物质基础。

附图说明

图1为实施例中东亚砂藓总rna图；

图2为实施例中pjpip2-1基因的扩增结果图；

图3为实施例中重组质粒p-rjpjpip2-1双酶切结果图；

图4为实施例中重组质粒pri-rjpjpip2-1双酶切结果图；

图5为实施例中烟草再生体系建立过程中生芽培养图；

图6为实施例中烟草再生体系建立过程中生根培养图；

图7为实施例中烟草再生体系建立过程中室外培养图；

图8为实施例中转基因烟草t1代pcr结果图；其中，m：1-14：转化植株；15：非转化植株；16：纯水对照。

图9为实施例中转基因烟草干旱胁迫前植株表型图；

图10为实施例中转基因烟草干旱胁迫15d植株表型图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示。

本实施方式提供的东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因来自东亚砂藓。以东亚砂藓为实验材料，克隆出与抗旱相关的水通道蛋白基因，并进行转基因，已获得抗旱转基因植株，可为植物基因工程育种提供优良基因资源，同时为改良植物的抗逆性提供物质基础。

具体实施方式二：本实施方式编码东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示。

具体实施方式三：本实施方式东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因的应用是指在提高植物抗旱性上的应用。

通过以下实验验证本发明的效果：

实施例1：

一、pjpip2-1基因的克隆

1、以东亚砂藓为材料，采用改良的sds法提取总rna。

(1)将-80℃保存的东亚砂藓材料取出，迅速放入到预冷的研钵中，加入少量pvp抗氧化剂，液氮中研磨至粉末，转入1.5ml灭菌离心管中；

(2)向管中分别加入氯仿(350μl)、tris-酚(350μl)和sds溶液(750μl)，漩涡震荡15min后，放入4℃离心机中12000r/min离心10min；

(3)吸取上清液至新离心管中，分别加入氯仿(350μl)和tris-酚(350μl)，常温震动8min后置于低温离心机13000r/min离心10min；

(4)重复步骤(3)；

(5)移液枪小心抽取上清液置新离心管，加入相同体积的氯仿溶液，常温震荡8min后13000r/min离心10min；

(6)吸取上清液，向管中加入1/2体积的无水乙醇溶液和1/2体积的licl溶液，轻轻混匀后于-20℃静置50min，放到低温离心机以10000r/min的速度离心20min，倒掉上清溶液；

(7)将沉淀用75％乙醇溶液洗涤2次，每次5分钟，冰浴干燥沉淀至无味，加入少量的depc水溶液，轻轻震荡溶解后可在-80℃中保存；

(8)分别用1.0％浓度的凝胶电泳检查东亚砂藓总rna的清晰度及完整程度，核酸蛋白浓度检测仪检测总rna的浓度。

2、总rna的纯化

总rna提取过程中会参杂少量的dna，可通过dnaseⅰ消化酶去除，方法如下：

(1)取无菌的离心管，向管中分别放入下列试剂，轻轻混匀，37℃环境下水浴25min；

(2)向管中加入100μl的ci溶液和70μl的depc水溶液，离心3min；

(3)移液枪吸出上层溶液，加入400μl无水乙醇，-80℃静置1h后取出,10000r/min离心沉淀18min；

(4)弃废液，加入预冷的75％乙醇溶液1ml溶解沉淀，4℃离心机10000r/min离心沉淀8min；

(5)弃废液，冰浴干燥至无味，加入少量depc水溶液，轻轻混匀溶解，；

(6)用上述方法检测纯化总rna的浓度、纯度及完整性，-80℃保存备用。

总rna提取结果如图1所示。

3、cdna第一链的合成

以rna为模板，按照promega公司m-mlv反转录酶说明书对2μg总rna进行逆转录，合成cdna第一链。

4、基因克隆

以cdna为模板，进行目的基因pjpip2-1的pcr扩增，反应体系及反应程序如下：

pjpip2-1-f：5′-gcgtcgacatctagttcgtgtcgcgctt-3′

pjpip2-1-r：5′-ccggaattcccctgagtgataccctgaatg-3′

将得到的pcr产物进行电泳检测和胶回收，与pmd-18t载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序，得到全长为全1267bp的序列，其核苷酸序列如序列表中的seqidno：1所示，编码具有序列表中seqidno：2的氨基酸序列的蛋白质。pjpip2-1蛋白的立体结构预测结果与aqp的四聚体模式基本一致。通过亲/疏水性分析，pjpip2-1蛋白为疏水性蛋白，这与膜蛋白的疏水性吻合。通过跨膜结构域分析，pjpip2-1蛋白具有六个跨膜结构域，信号肽预测，该蛋白没有信号肽位点，属于非分泌性蛋白质类。亚细胞定位表明pjpip2-1蛋白定位于质膜的机率是47.8％，这些特点符合植物体水通道蛋白pip亚家族的基本特征，初步确定获得了东亚砂藓水通道蛋白基因家族的新成员，命名为rjpjpip2-1。结果如图2所示。

二、含有目的基因rjpjpip2-1表达载体的构建

1、提取含有rjpjpip2-1基因的t载体质粒和表达载体pri101-an质粒，用sali和ecori限制性内切酶进行双酶切，获得带有粘性末端的rjpjpip2-1基因的cdna片段，结果如图3所示。

克隆载体双酶切反应体系如表1所示。

表1

三、连接转化至根癌农杆菌eha105

1、将rjpjpip2-1基因克隆载体酶切产物和表达载体pri101-an的酶切产物用t4dnaligase连接，具体操作按说明书进行，命名为pri-rjpjpip2-1。连接反应体系如表2所示。

表2

混合均匀后离心，16℃连接过夜。

连接后进行重组质粒的双酶切鉴定，结果如图4所示，显示出现两条条带，大片段为载体小片段为目的片段，说明重组质粒鉴定成功。

2、采用冻融法转化根癌农杆菌。

(1)将1重组质粒pri-rjpjpip2-1加入到根癌农杆菌eha105感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min；

(2)快速置于液氮中冷冻5min，即刻取出置于37℃温水中放置5min；

(3)加入700μl液体yeb培养基，28℃环境下，160rpm振动培育4h；

(4)常温4000rpm快速离心5min，倒掉上层溶液，加入80μl的液体yeb培养基悬浮沉淀；

(5)将悬浮液匀称平铺在添加抗生素的固体yeb培养基上，28℃环境中倒放培养3d；

(6)挑取单菌落于20ml含抗生素的液体yeb培养基内，28℃恒温以200rpm的速度震动培养；

(7)提取质粒，以菌液为模板使用特异性引物进行pcr鉴定；

四、转基因烟草的获得

1、农杆菌介导法转化烟草

(1)将含有rjpjpip2-1目的基因的农杆菌进行一次活化，吸取0.2ml菌液至20ml含抗生素(rif、kana、50μg/ml)的yeb液体培养基内，28℃震动培养箱中以180rpm的速度恒温振动摇菌18h，再次吸取1ml活化的培养液至新的含抗生素(rif、kana、50μg/ml)yeb培养基中震荡培养进行二次活化，直至od600达0.5左右；

(2)取长势较好的烟草叶片，剪成面积大小为1cm²的小片；

(3)将叶片放到二次活化的菌液中，轻微震荡80s后，至无菌滤纸晾干，用灭菌的镊子将叶片背片朝上放置在ms分化培养基上，黑暗共培养2d；

(4)用无菌水清洗暗培养后的叶片，再转入到含有抗生素cef和km的固体ms培养基上(含6-ba和naa)，每两周进行一次继代；

(5)待其小苗长到3cm左右，移至生根培养基，待其生根；

(6)将根部粗壮且多须根的无菌苗移到灭菌的花土中(花土：蛭石＝3：1)；

(7)室内常温培养至开花接种，所得种子为t0代烟草种子。

结果如图5～7所示。其中图5为转基因烟草幼芽，图6为转基因烟草生根培养，图7为室外培养的转基因烟草植株。

2、t0代烟草幼苗的培养

选取t0代转基因烟草与野生型烟草种子，先用75％酒精消毒5min，再用10％的naclo消毒10min，然后无菌水洗5-7遍。将消毒好的种子分别平铺于1/2ms(含50mg/lkan)和1/2ms培养基中获得t1代植株。

3、t1代转基因烟草的筛选及鉴定

t0代烟草种子在含有卡那的培养基中若能正常生长则是转基因植株，反之逐渐白化死亡。选取野生型与转基因植株长势一致的t1代植株，将其移至土壤中继续培养，等烟草长势稳定后，用ctab法提取t1代植株的dna，进行pcr扩增，在转基因t1代植株中可以检测到rjpjpip2-1基因的表达，而在野生型烟草中不表达。结果如图8所示(1-14：转化植株；15：非转化植株；16：纯水对照；)。

对野生型和转基因烟草进行干旱胁迫，观察其表型变化。结果如图9～10所示。干旱胁迫前，各株系烟草植株没有明显的表型差异，生长发育正常，叶色、株高等方面差别不大(图9)，但在干旱胁迫15d后，野生型植株萎蔫严重受，转基因植株干旱影响相对较小(图10))。

由此可知，rjpjpip2-1基因与细胞膜的透水能力、干旱条件下生理生化现象密切相关，将其转入植株中可提高其抗旱性，为培育耐旱的植物新品种，增强植物的抗逆性奠定基础，具有重要意义。

序列表

<110>齐齐哈尔大学

<120>东亚砂藓水通道蛋白rjpjpip2-1基因及其编码蛋白和应用

<160>4

<210>1

<211>1267

<212>dna

<213>东亚砂藓racomitrunmjaponicum

<400>1

gaggcggcttcgtaggttacgcctcgacaaggcagtacctgattgtggacatgcttctgg60

ttcagttggaaagtaggctgctatcgtttccttaaaccagcccacgcttaagcttccaga120

ggcctgcttagccttgcttagggaggtccagaaagctgaatgaaggttgagcgctttcgc180

ggtgcaacctgaattcatcatttcgtcgcctgcttctgctttttcttcgacggcccccga240

ttcagatagcagttgcactttgagatacaatctactgttggcaaaccctcatagtaatag300

gcgatgacgaatgaagatggccccaaggacttgtcagagccggcgccggctccactggtg360

gacacgaaggaagtcggtgactggtcgttctaccgagcttgtattgcagaattcgtcgca420

actcttcttttcctctacatcagcctcaccactctggttggcactatcaggattggcgct480

ggcaatgtggggcttcttgaaacagcctgggcattcggaggaatgatcttcatcttggtc540

tactgcattgcaggcatttcaggtggacacattaacccagctgttacattcggtctcttc600

ctcgccaaaaagatcaccatcacgagaactatagcctacgtcgtagctcagtgcttagga660

gccatgtgcggcgctgcaattgcaaggggcgttcaaggaagtgaagagtttcagaacttt720

ggccaaggtgcagtgaatggtgtgaagggagggcacagtatcggacaagctcttgctgct780

gagataatgggcacgtttgtgctcctctatactgtgctgtctgcaactgatccaatgcgc840

atggctcgagactctcatgttcctgtattggctccactgcccataggatttgcaattttt900

gtggttcacctggcaaccatacctatcaccgggacaggaatcaacccagctcgaagctta960

ggtgctgcaattgccaaccctcagcatggcaactgggcccaacattggattttttgggtt1020

ggacccatgcttggagctgctgctgctgctatgtaccacacttatgtgctgaaagcctca1080

tcattcacgttcagaagtctgtatgagtagtagcctataggagaattctattaccgtgat1140

aggacttagcaaagtgctgcgctttcgagtgagaggcactcgtagagaatgatatttaat1200

tgtgcagagtagaggtattgtctgacaatatatgtagagaacagttcttgtatgtaggtc1260

gctgtgc1267

<210>2

<211>268

<212>prt

<213>东亚砂藓racomitrunmjaponicum

<400>2

metthrasngluaspglyprolysaspleusergluproalapro

151015

alaproleuvalaspthrlysgluvalglyasptrpserphetyr

202530

argalacysilealagluphevalalathrleuleupheleutyr

354045

ileserleuthrthrleuvalglythrileargileglyalagly

505560

asnvalglyleuleugluthralatrpalapheglyglymetile

657075

pheileleuvaltyrcysilealaglyileserglyglyhisile

808590

asnproalavalthrpheglyleupheleualalyslysilethr

95100105

ilethrargthrilealatyrvalvalalaglncysleuglyala

110115120

metcysglyalaalailealaargglyvalglnglysergluglu

125130135

pheglnasnpheglyglnglyalavalasnglyvallysglygly

140145150

hisserileglyglnalaleualaalagluilemetglythrphe

155160165

valleuleutyrthrvalleuseralathraspprometargmet

170175180

alaargaspserhisvalprovalleualaproleuproilegly

185190195

phealailephevalvalhisleualathrileproilethrgly

200205210

thrglyileasnproalaargserleuglyalaalailealaasn

215220225

proglnhisglyasntrpalaglnhistrpilephetrpvalgly

230235240

prometleuglyalaalaalaalaalamettyrhisthrtyrval

245250255

leulysalaserserphethrpheargserleutyrglu

260265268

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物pjpip2-1-f的核苷酸序列。

<400>3

gcgtcgacatctagttcgtgtcgcgctt28

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物pjpip2-1-r核苷酸序列。

<400>4

ccggaattcccctgagtgataccctgaatg30