本发明属于微生物修复受污染土壤和水体技术领域，尤其涉及一种可降解多环芳烃的降解菌及其应用。
背景技术：
多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons，pahs)是一类环境中普遍存在的有机污染物。由于其具有毒性、至突变、至诱变性、致癌性和难降解的特性，对环境和公众健康造成了巨大的危害。随着多环芳烃对环境和人类许多方面的危害被逐渐了解，现在越来越多的研究者开始致力于研究如何更加有效的去除环境中的pahs。在自然环境中多环芳烃通过吸附、挥发、光降解和化学氧化进行降解。海洋是pahs的重要汇集地，陆地上和大气中的pahs可通过入海径流、大气沉降等方式进入海洋，同时海上石油泄漏等意外事故也会造成pahs污染。此外，pahs也能够通过再悬浮作用又会重新释放到环境中，从而造成“二次污染”。由于pahs较高的亲脂性，进入海洋环境中的pahs容易转移到生物体和沉积物中，并通过食物链进入人体，对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害。由于pahs的上述危害，美国环境保护局(usepa)早在20世纪80年代就把16种不带支链的pahs列为环境中优先治理污染物，而我国环境保护部门也将pahs列入优先监测与控制的环境污染黑名单中。
众多研究表明，微生物降解在污染物的迁移转化乃至最终从环境中去除的过程中占有重要的地位,是环境中pahs和重金属去除最主要的途径。同时，微生物修复具备温和、高效和经济的特点。但现有多环芳香烃降解菌株的资源储备还很有限，严重限制了环境污染物pahs生物修复技术的进一步发展。
技术实现要素：
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种能有效降解多环芳烃的降解菌。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述降解菌在降解多环芳烃中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该盐单胞菌属细菌株halomonassp.bn3-1，其特征在于：其核苷酸序列如seqidno.1所示。
该菌株是一株中度嗜盐菌株，其盐度生长范围为0-20％(最适生长范围为7-10％)，因此其可以在盐度较高的环境中降解pahs，从而达到将pahs从环境中去除的效果。
进一步地，所述盐单胞菌属细菌株halomonassp.bn3-1的保藏编号为cgmccno.14838。
本发明为解决第二个技术问题提供了一种盐单胞菌属细菌株halomonassp.bn3-1在降解多环芳烃中的应用，其特征在于：对多环芳烃中的菲降解效率可达到70％～74％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明的盐单胞菌属细菌其降解多环芳烃的速度较快，该盐单胞菌属细菌在100ml培养基(菲的溶度为100mg/l)中培养一周，菌株bn1-1、bf1-1、bn3-1对菲的降解率分别为30％、33％、74％，其中菌株bn3-1具有更高的降解率。
保藏说明
1、盐单胞菌属细菌株bn3-1,分类命名halomonassubmarina，于2017年10月27日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.14838。
附图说明
图1为本发明中菌株bn3-1菌落形态图。
图2为本发明中升华法制备pahs固体培养基的系统装置图。
具体实施方式
以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)样品的采集：
泥样为2013年10月中国海洋六号科考船第29次科于东太平洋结合区wbc1306(经度w154.235，纬度n10.016)站位点采集的沉积物泥柱。
(2)pahs的溶解：
在高压灭菌处理的三角瓶中加入多环芳烃化合物菲、萘、芘、荧蒽的丙酮溶液，将其放置与37℃摇床震旦过夜至丙酮溶液完全挥发，加入细菌培养基i，使多环芳烃化合物萘、菲、芘、荧蒽最终浓度为分别为200mg/l，100mg/l，50mg/l和20mg/l。
该细菌培养基i为：柠檬酸铁0.10g、nacl19.45g、mgcl25.90g、na2so43.24g、cacl21.80g、kcl0.55g、nahco30.16g、kbr0.08g、srcl234.00mg、h3bo322.00mg、硅酸钠4.00mg、naf2.40mg、(nh4)no31.60mg、na2hpo48.00mg、1ml微量元素、1ml维生素复合溶液、去离子水1l、ph7.2。若为固体培养基则加入1.5％琼脂粉。
其中微量元素溶液的组成为:cocl2·6h2o35mg、cucl20.20mg、h3bo36.0mg、mncl·4h2o25mg、na2moo4·2h2o3.0mg、nicl·2h2o2.0mg、zncl22.5mg、去离子水1l。
维生素复合溶液的组成为：维生素b61.0mg、维生素c1.5mg、去离子水1l。
(3)pahs降解菌的富集
每个站位表层沉积物取5g置于无菌的50ml离心管中，置于50ml离心管中，加入40ml无菌陈海水，振荡混合10min后放置在4℃冰箱过夜使菌体复苏。每个样品取10ml上清液添加100mlpahs富集培养基i中，其中多环芳烃化合物分别为菲、萘、芘、荧蒽其含量分别为200mg/l，100mg/l，50mg/l，20mg/l，16℃、160rpm/min、避光富集培养至培养基变浑浊(一周左右)。将富集培养液按照2％比例转接到新鲜相富集培养基中，同等条件继续富集培养5次。该步骤重复5次直到微生物种群稳定。分别取上述富集培养液1ml，用无菌陈海水分别稀释至10-3、10-4、10-5三个梯度，涂布于2216平板上，置于16℃恒温培养箱倒置培养两周。
(4)pahs降解菌的分离纯化、鉴定
挑取菌落形态特征各异的单菌落划线与新鲜培养基ii板上培养，16℃培养15d，重复划线纯化3代。纯化的分离菌株进行16srrna基因序列测序等菌株鉴定。
培养基ii：蛋白胨5.00g、酵母粉1.00g、柠檬酸铁0.10g、nacl19.45g、mgcl25.90g、na2so43.24g、cacl21.80g、kcl0.55g、nahco30.16g、kbr0.08g、srcl234.00mg、h3bo322.00mg、硅酸钠4.00mg、naf2.40mg、(nh4)no31.60mg、na2hpo48.00mg、1ml微量元素溶液、1ml维生素复合溶液、去离子水1l、ph7.2。
实施例2
(1)升华法制备pahs固体培养基:
由于pahs化合物强疏水性，只能溶于有机溶剂中的物理特性，导致多环芳烃无法用通常的方法添加到固体培养基中。为此，利用多环芳烃化合物易升华的物理特性来制得多环芳烃固体培养基。
具体方法步骤如下：
(1)先制作两个铝制的碟子，碟子的口径与培养皿底盖直径相同，使其能够正好扣在铝碟上方。
(2)准备一台恒温加热仪；
将恒温加热器放置于通风橱中，并将铝制的碟子放置其正上方预热半小时。
(3)取适量的多环芳烃化合物均匀的平铺在铝碟的底部，并将含有培养基i的平板放置在铝碟上方，同时将另外一个碟子装满冰放在平板背面，直到培养基表面镀上一层多环芳烃化合物。
上述整个操作过程需在通风橱中完成。通常的多环芳烃化合物进行升华的加热温度为低于该化合物熔点5℃，这样可以保持pahs化合物始终保持固体状态。
该系统的装置如图2所示(图1中铝制的碟子对应标号-1，培养皿对应标号-2，恒温加热仪对应标号-3，培养基i对应标号-4，多环芳烃化合物对应标号-5，冰块对应标号-6)。
实施例3
利用pahs菲固体培养基对菌株降解pahs的能力进行初步的判定
制备固体培养基i，利用升华法在培养基i表面镀一层菲化合物获得菲固体培养基。将之前富集获得菌株接种于ii液体培养基置于摇床160rpm避光培养(25℃)48h。取高压灭菌处理过的直径为5mm的纸片在菌液中沾湿之后将其贴在pahs培养基上置于25℃恒温培养箱中培养。根据菌株是否在pahs固体培养基上生长以及菌落周围透明圈，初步判定该菌株降解pahs的能力。如果生长，说明对pahs具有耐受性，如菌落周围有透明圈出现，则说明该菌株具有pahs降解能力，反之，如果菌落周围没有透明圈出现，则说明该菌株不具有多环芳香烃降解能力，并且根据降解圈的大小判断菌株的降解能力大小，即透明圈大小与降解能力成正比。
实施例4降解多环芳烃效率的初步结果
通过上述富集、分离方法一共获得36株细菌。其隶属于变形菌门(proteobacteria)、放线菌门(actinobacteria)，隶属于α-变形菌纲(alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(gammaproteobacteria)、放线菌纲(actinobacteria)其隶属于属于6个属8个种，其中包括aurantimonascoralicida、thalassospirapovalilytica、pseudomonasstutzeri、pseudomonaszhaodongensis、cobetiaamphilecti、rhodococcuserythropolis、halomonasdenitrificans、pseudomonasplecoglossicida。
根据菌株在pahs菲固体培养基上生长情况以及菌落周围是否有降解圈及降解圈的大小来初步判断菌株降解pahs能力的强弱，站位wbc1306站位菌株降解能力大小的判定结果：
注：-代表不生长，+代表有菌落生长，++代表降解力弱，+++代表降解力良好
上表显示站位wbc1306中菌株thalassospirapovalilytica、pseudomonas、zhaodongensis、halomonasdenitrificans、cobetiaamphilecti对pahs菲的降解能力良好，菌株pseudomonasstutzeri、rhodococcuserythropolis、aurantimonascoralicida则对pahs菲的降解能力较弱；该站位分离菌株对pahs菲都具有耐受作用和降解能力。菌株bn3-1菌落形态为圆形、低凸、湿润、颜色从一开始的乳白色到后期变为土黄色，如图1所示。
实施例5菌株bn3-1、bn1-1、bf1-1对菲降解效率的测定
取对数生长期菌株bn3-1、bn1-1、bf1-1培养液接种到100ml含100mg菲的培养基i中做实验组，设不接种培养液的为对照组。在160rpm，28℃摇床中避光震荡培养一周提取剩余pahs，分别测定实验组和对照组中多环芳烃化合物的残留率，然后利用实验组合对照组的残留率计算降解效率。培养基中剩余pahs的萃取向培养基中加入30mlchcl3萃取未被降解的pahs，200rpm摇床振荡30min，然后超声处理20min，然后再加入30mlchcl3，200rpm摇床继续振荡30min，然后用分液漏斗萃取约60ml的chcl3，用chcl3定溶到100ml，混匀，准确取定溶后的溶液1ml，加入适量的无水na2so4(事先在150℃，烘烤2hours)脱水，12000rpm，离心5min，随后准确移出一定体积进行适当倍数的稀释(记住稀释倍数，一边最后计算结果)。接着，取1ul稀释后的萃取液，进行gc-ms分析，将得到的某种pahs的峰面积带入相应的标准曲线中，求出该种pahs的浓度。进行三次重复试验，结果取平均值，bn1-1、bf1-1、bn3-1对菲的降解率分别为30％、33％、74％。降解效率＝(对照组多环芳烃总量-实验组多环芳烃含量)/对照组pahs含量*100％。
序列表
<110>浙江万里学院
<120>一种可降解多环芳烃的海洋降解菌及其应用
<130>notpublishedyet
<141>2017-10-30
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1558
<212>dna
<213>halomonassp.bn3-1
<400>1
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