本发明涉及天然产物深加工技术领域，特别涉及一种土鳖虫多糖的提取方法。
背景技术：
土鳖虫又名地鳖、土别虫，是鳖蠊科昆虫地鳖(eupolyphagasinesiswalker)或冀地鳖(eupolyphagasinesis(boleny))的雌虫干燥体，主产福建、河北、广西、广东、山东等地，性寒味咸，通心肝脾，是传统的活血化瘀类中药。明代李时珍的《本草纲目》中就有关于其药用的记载，它是传统的活血化瘀类昆虫药，有调整脂质代谢、抗脂质过氧化反应、保护内皮细胞作用。土鳖虫含有多种微量元素、脂肪酸类、氨基酸、多肽或蛋白质、糖类、生物碱、有机酸盐、甾体化合物等，在众多成分中，中药多糖具有免疫调节，抗肿瘤，抗氧化，降血糖，抗黏附，抗衰老，抗突变，肾脏保护，肝脏保护，防辐射，抗病毒，抗疲劳等药理作用。其中抗肿瘤和免疫调节活性较为突出。故近年来，中药多糖的研究十分活跃。与植物多糖相比，由动物体内提取的多糖，与人体细胞有更好的生物兼容性；同时由于单糖残基种类多，导致连接位置和糖苷键变化更多，因此结构更为复杂，活性可能更突出，近年来受到越来越多的关注。组成动物多糖的单糖残基不仅有植物来源多糖常见的葡萄糖、半乳糖、果糖等，更连接有己糖醛酸基、酰基和氨基，具有更为广泛的生物活性。遗憾的是，目前国内外多糖的研究多集中在植物与菌类，而对于动物多糖的研究相对较少。
现有技术如授权公告号为cn103819575b的中国发明专利，公开了一种土鳖虫多糖的提取方法、提取的多糖以及该多糖的用途，步骤如下：（1）脱脂：将干燥土鳖虫雌体粉碎，过筛，加入溶剂脱脂，回流，抽滤，滤渣挥干溶剂待用；（2）超声处理；（3）酶处理：调整ph，然后用复合酶水解，然后升温至85℃灭酶，抽滤，收集滤液，浓缩，得到浓缩提取液；（4）醇沉：将步骤（3）所得浓缩提取液加入乙醇，放置24小时析出土鳖虫粗多糖沉淀，抽滤，用95wt%乙醇和丙酮洗涤两次，50-70℃真空干燥，得到土鳖虫多糖。该提取方法具有提取条件温和、提取率高、成本低廉、操作简单、环境友好等优点。但是该提取方法得到的多糖纯度不够，含有杂蛋白和小分子物质。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，资源利用率高，提取速率快，提取率高，多糖的提取效率高、纯度高，脱脂彻底的一种土鳖虫多糖的提取方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种土鳖虫多糖的提取方法，包括脱脂、超声波-微波提取、脱色，其具体步骤为：
脱脂：将土鳖虫粉碎成粗粉，加入5-6倍土鳖虫重的混合溶剂，混合溶剂中石油醚和丙酮的体积比为1:0.7-0.8，在温度为40-50℃、功率为100-150w下超声波脱脂35-42min，过滤，滤渣经低温烘干、粉碎制成脱脂土鳖虫粉，多糖的组织细胞多有脂质包围，组织中往往含有较多的蛋白，所以要先进行脱脂处理，超声波振动能产生并传递强大的能量，给于溶剂大速度和加速度，超声波的空化作用使媒质被撕裂成很多的小空穴，这些小空穴瞬时生成、生长、崩溃会产生高达几千个大气压的瞬时压力，使脂肪组织软化、损伤，加速溶剂在组织中的渗透和扩散，从而使油脂加速渗透出来，可以除去土鳖虫中的脂肪，同时混合溶剂中含有溶剂重量0.022-0.025%的两性霉素和溶剂重量0.011-0.013%的5-氟胞嘧啶，两性霉素和5-氟胞嘧啶的加入不仅能够大大提高溶剂脱脂速率，降低溶剂的用量，且脱脂彻底，还可以土鳖虫细胞膜物质相结合，损伤膜的通透性，为提取细胞膜内的多糖成分作准备；
超声波-微波提取：将脱脂土鳖虫粉浸泡于20-30倍重量的蒸馏水中，再加入多功能活性蛋白，然后在70-80℃下用超声微波萃取仪处理40-50min，冷却至室温，在4000-5000r/min下离心12-16min，将上清液浓缩至原体积的1/4-1/2，装入透析袋透析，除去小分子杂质和盐类，加入3-4倍体积的无水乙醇进行沉淀，静置过夜，在4000-5000r/min下离心12-16min，将沉淀用3-5倍的蒸馏水溶解，采用反复冻融法去除蛋白，反复13-18次，在4000-5000r/min下离心12-16min，然后用sevage法去蛋白，上清液用透析袋透析，浓缩，冷冻干燥，即得土鳖虫多糖，超声微波提取使脱脂土鳖虫粉与水作相对运动，始终保持较高的浓度差，土鳖虫粉中有效成分很容易溶入水中，可降低溶剂用量，提高有效成分提取率，使细胞疏松甚至破碎，其中的有效成分快速溶入水中，缩短了提取时间，减少能源消耗，更适合工业化生产的发展方向；
脱色：将nka-9大孔吸附树脂装入层析柱中，在20-25℃下将浓度为8-12mg/ml、ph为7.8-8.3的土鳖虫多糖溶液以0.8-1.1bv/h流速上样，然后用去离子水洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得土鳖虫多糖，该nka-9大孔树脂吸附能力强，物理吸附作用结合色素达到脱色目的，不影响多糖结构，脱色能力较大，脱色范围较广，脱色容量高，容易洗脱，再生也比较简便，对多糖的结构破坏小、方便可行，而且脱色率及多糖的保留率都较高，同时能除去杂蛋白、无机盐等。
优选的，多功能活性蛋白和脱脂土鳖虫粉的重量比为0.31-0.36:10000，其氨基酸序列为tdhklcvvncfcgaakcylcrvlhpgkcvcvncskqnayasaiprchggktcegicatatmdrysdtggplstarcvnafhgfykgcslyenvsykpfvvswkygvagfyhcgpnfccis，该多功能活性蛋白易溶于水，能通过电荷作用与脱脂土鳖虫粉相结合，提高脱脂土鳖虫粉在水中的分散性，避免团聚现象的发生，使得超声微波能更好地作用于土鳖虫粉，提高多糖的提取率，同时能让提取出来的多糖快速溶于水中，缩短了提取时间，减少能源消耗。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明提取方法简单可行，提取速率快，多糖的提取率和纯度较高，可降低水和溶剂用量，减少能源消耗，更适合工业化生产的发展方向；2）该提取方法采用超声微波提取，同时采用反复冻融法和sevage法去蛋白，缩短了多糖提取时间，提高了蛋白质的去除率，减少了多糖的损失，能保存多糖原有的结构与活性；3）本发明脱脂处理可以除去土鳖虫中的脂肪，脱脂速率高，石油醚的用量少，脱脂彻底，且可损伤土鳖虫细胞膜的通透性，利于土鳖虫多糖的提取；4）利用大孔树脂的物理吸附作用结合色素达到脱色目的，不影响多糖结构，脱色能力较大，脱色范围较广，脱色容量高，容易洗脱，再生也比较简便，对多糖的结构破坏小、方便可行。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种土鳖虫多糖的提取方法，包括脱脂、超声波-微波提取、脱色，其具体步骤为：
脱脂：将土鳖虫粉碎成粗粉，加入5-6倍土鳖虫重的混合溶剂，混合溶剂中石油醚和丙酮的体积比为1:0.7-0.8，在温度为40-50℃、功率为100-150w下超声波脱脂35-42min，过滤，滤渣经低温烘干、粉碎制成脱脂土鳖虫粉，上述混合溶剂中含有溶剂重量0.022-0.025%的两性霉素和溶剂重量0.011-0.013%的5-氟胞嘧啶；
超声波-微波提取：将脱脂土鳖虫粉浸泡于20-30倍重量的蒸馏水中，再加入多功能活性蛋白，然后在70-80℃下用超声微波萃取仪处理40-50min，冷却至室温，在4000-5000r/min下离心12-16min，将上清液浓缩至原体积的1/4-1/2，装入透析袋透析，除去小分子杂质和盐类，加入3-4倍体积的无水乙醇进行沉淀，静置过夜，在4000-5000r/min下离心12-16min，将沉淀用3-5倍的蒸馏水溶解，采用反复冻融法去除蛋白，反复13-18次，在4000-5000r/min下离心12-16min，然后用sevage法去蛋白，上清液用透析袋透析，浓缩，冷冻干燥，即得土鳖虫多糖，上述多功能活性蛋白和脱脂土鳖虫粉的重量比为0.31-0.36:10000，其氨基酸序列为tdhklcvvncfcgaakcylcrvlhpgkcvcvncskqnayasaiprchggktcegicatatmdrysdtggplstarcvnafhgfykgcslyenvsykpfvvswkygvagfyhcgpnfccis；
脱色：将nka-9大孔吸附树脂装入层析柱中，在20-25℃下将浓度为8-12mg/ml、ph为7.8-8.3的土鳖虫多糖溶液以0.8-1.1bv/h流速上样，然后用去离子水洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得土鳖虫多糖。
实施例2：
一种土鳖虫多糖的提取方法，包括脱脂、超声波-微波提取、脱色，其具体步骤为：
脱脂：将土鳖虫粉碎成粗粉，加入6倍土鳖虫重的混合溶剂，混合溶剂中石油醚和丙酮的体积比为1:0.7，在温度为50℃、功率为100w下超声波脱脂42min，过滤，滤渣经低温烘干、粉碎制成脱脂土鳖虫粉，上述混合溶剂中含有溶剂重量0.025%的两性霉素和溶剂重量0.011%的5-氟胞嘧啶；
超声波-微波提取：将脱脂土鳖虫粉浸泡于30倍重量的蒸馏水中，再加入多功能活性蛋白，然后在70℃下用超声微波萃取仪处理50min，冷却至室温，在5000r/min下离心12min，将上清液浓缩至原体积的1/2，装入透析袋透析，除去小分子杂质和盐类，加入4倍体积的无水乙醇进行沉淀，静置过夜，在5000r/min下离心12min，将沉淀用3倍的蒸馏水溶解，采用反复冻融法去除蛋白，反复13次，在5000r/min下离心12min，然后用sevage法去蛋白，上清液用透析袋透析，浓缩，冷冻干燥，即得土鳖虫多糖，上述多功能活性蛋白和脱脂土鳖虫粉的重量比为0.36:10000，其氨基酸序列为tdhklcvvncfcgaakcylcrvlhpgkcvcvncskqnayasaiprchggktcegicatatmdrysdtggplstarcvnafhgfykgcslyenvsykpfvvswkygvagfyhcgpnfccis；
脱色：将nka-9大孔吸附树脂装入层析柱中，在25℃下将浓度为12mg/ml、ph为7.8的土鳖虫多糖溶液以0.8bv/h流速上样，然后用去离子水洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得土鳖虫多糖。
实施例3：
一种土鳖虫多糖的提取方法，包括脱脂、超声波-微波提取、脱色，其具体步骤为：
脱脂：将土鳖虫粉碎成粗粉，加入5.5倍土鳖虫重的混合溶剂，混合溶剂中石油醚和丙酮的体积比为1:0.75，在温度为45℃、功率为120w下超声波脱脂40min，过滤，滤渣经低温烘干、粉碎制成脱脂土鳖虫粉，上述混合溶剂中含有溶剂重量0.024%的两性霉素和溶剂重量0.012%的5-氟胞嘧啶；
超声波-微波提取：将脱脂土鳖虫粉浸泡于25倍重量的蒸馏水中，再加入多功能活性蛋白，然后在75℃下用超声微波萃取仪处理45min，冷却至室温，在4500r/min下离心14min，将上清液浓缩至原体积的1/3，装入透析袋透析，除去小分子杂质和盐类，加入3.5倍体积的无水乙醇进行沉淀，静置过夜，在4500r/min下离心14min，将沉淀用4倍的蒸馏水溶解，采用反复冻融法去除蛋白，反复15次，在4500r/min下离心14min，然后用sevage法去蛋白，上清液用透析袋透析，浓缩，冷冻干燥，即得土鳖虫多糖，上述多功能活性蛋白和脱脂土鳖虫粉的重量比为0.34:10000，其氨基酸序列为tdhklcvvncfcgaakcylcrvlhpgkcvcvncskqnayasaiprchggktcegicatatmdrysdtggplstarcvnafhgfykgcslyenvsykpfvvswkygvagfyhcgpnfccis；
脱色：将nka-9大孔吸附树脂装入层析柱中，在23℃下将浓度为10mg/ml、ph为8.0的土鳖虫多糖溶液以1.0bv/h流速上样，然后用去离子水洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得土鳖虫多糖。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>海盐县凌特生物科技有限公司
<120>一种土鳖虫多糖的提取方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>120
<212>prt
<213>人工合成(mytiluscoruscus)
<400>1
thrasphislysleucysvalvalasncysphecysglyalaalalys
151015
cystyrleucysargvalleuhisproglylyscysvalcysvalasn
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