基因MYC2在提高植物耐低温能力中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及基因myc2在提高植物耐低温能力中的应用。

背景技术：

由于植物的不可移动性，植物的生长发育对环境变化及其敏感，当遭受外界非生物逆境胁迫时，影响植物的生长，限制作物的产量。近年来，随着全球气候的极端变化，低温越来越成为一种影响广泛的非生物逆境，对植物的正常生长和农业生产造成了极大的破坏。因此，研究植物响应低温逆境的生理生化变化和分子机理，寻找调控植物低温响应的关键基因，为获得耐低温植物的获得提供重要的理论支持，对提供作物产量有着关键的应用价值。

目前植物分子生物学研究多以拟南芥(arabidopsisthaliana)为模式植物进行研究，拟南芥属于十字花科植物，具有基因组小，生长较快等优势，被广泛用于植物遗传学、细胞生物学、分子生物学等研究中。以拟南芥为模式植物研究植物对低温逆境响应的分子机理，可以更快较好的阐述植物低温应答的分子机制，从而为提高培育作物的耐低温植物提供理论依据。一般通过农杆菌侵染或者其他转基因方法的方法，可以将相关基因克隆载体转到野生型拟南芥中，获得该基因的过表达或基因敲除株系，然后再进行植物耐受性实验检测，研究该基因在相关逆境中的功能，可以得知该基因在相应逆境中发挥的功能，从而发掘耐逆境胁迫基因资源。

技术实现要素：

本发明的目的是提供基因myc2在提高植物耐低温能力中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的基因myc2在提高植物耐低温能力中的应用，所述基因myc2cdna的核苷酸序列为：

i)seqidno:2所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与seqidno:2所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

myc2基因来源于哥伦比亚生态型拟南芥，在拟南芥基因组数据库中的编号为at1g32640。myc2基因由2179个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第76位到第1947位碱基。该基因读码框由1个外显子组成，读码框第1位到第1872位碱基均为外显子序列。由myc2基因编码的氨基酸序列如seqidno.1所示。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。

应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供含有植物耐低温的myc2基因序列或其片段的克隆载体或各类表达载体，含有所述载体的宿主细胞，含有所述基因序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。

本发明所述植物包括单子叶植物和双子叶植物，例如拟南芥等。将植物耐低温myc2基因在植物中过表达，包括利用任一种可以引导外源基因在植物中过表达的载体进行。

本发明还提供一种提高植物耐低温能力的方法，通过在植物中过表达基因myc2，从而提高植物对低温的耐受性；

本发明还提供一种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，所述方法具体为：提取拟南芥总rna，反转录获得cdna，以cdna为模板，f和r为引物，扩增myc2基因，将扩增产物分别构建到植物表达载体上，然后用获得的重组表达载体转化农杆菌，接着用转化的农杆菌侵染拟南芥花序，筛选阳性转基因植株，获得耐低温的转基因拟南芥。

其中，所述引物f和r的核苷酸序列如seqidno.3和4所示。

本发明使用的植物表达载体为具有35s启动子的表达载体，例如载体pgwb17或pgwb5。

前述的方法，优选所述农杆菌为gv3101。

前述方法中，所述拟南芥优选为野生型拟南芥植株，即具有纯合基因型的拟南芥植株。

将本发明的myc2基因过表达后，拟南芥表现为耐低温的表型。为了便于对转基因拟南芥植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。

本发明提供的myc2基因为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例2中myc2基因过表达拟南芥株系的植物蛋白westernblot检测结果；其中，a为转35s:myc2-myc拟南芥植株(oe-1)，b为转35s:myc2-gfp拟南芥植株(oe-2)。

图2为本发明实施例3中在非冷驯化和冷驯化条件下，转基因拟南芥oe-1和oe-2表现抗冻的表型。

图3为本发明实施例3中在非冷驯化和冷驯化条件下，转基因拟南芥oe-1和oe-2的存活率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验方法(tsuyoshinakagawaetal,developmentofseriesofgatewaybinaryvectors,pgwbs,forrealizingefficientconstructionoffusiongenesforplanttransformation,2007)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中pentrd-topo克隆载体为常用的克隆载体，可市购；pgwb17和pgwb5载体是由中科院遗传与发育研究所李传友教授实验室提供；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌gv3101菌株常用的克隆载体。

以下实施例中的主要试剂为：pentrd-topo、gateway分子克隆相关实验产品均购自invitrogen公司；taqdna聚合酶、t4连接酶、pyrobesttaq酶、kod、购自neb、toyobo等生物公司；dntps购自genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自axygen公司；ms培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(amp)、卡那霉素(kan)、硫酸庆大霉素(gen)、利福平(rif)等抗生素以及蔗糖(glucose)、牛血清白蛋白(bsa)、硝酸纤维素膜、lb培养基等购自sigma、bio-rad等公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。

实施例1myc2基因过表达载体的构建

为了解植物响应低温的分子机制，从拟南芥(arabidopsisthaliana)基因组中克隆了myc2基因。根据编码区序列分析，设计引物f和r，将该基因的编码区扩增出来，分别连接到过表达载体pgwb17和pgwb5上。

所用引物为：

上游引物f：5’-caccatgactgattaccggctaca-3’(seqidno.3)

下游引物r：5’-accgatttttgaaatcaaacttgc-3’(seqidno.4)

将myc2基因连接到载体pgwb17、pgwb5上的具体方法为：利用连接到pentr/d-topo克隆载体上的克隆，通过lp反应分别重组到pgwb17和pgwb5载体上(获得的重组表达载体分别命名为35s:myc2-myc和35s:myc2-gfp)，得到通过抗性筛选后的阳性克隆菌斑，试剂盒小量提取质粒并送测序，测序正确表明pgwb17和pgwb5载体中已连入myc2基因。

实施例2myc2基因过表达植物的构建和检测

将实施例1所述含有myc2基因的pgwb17和pgwb5载体分别转化到农杆菌gv3101菌株中，再分别转入野生型拟南芥植株中，得到拟南芥转基因幼苗。具体方法为：将含有目的载体的农杆菌接种于100mllb三抗液体培养液(卡那霉素50μg/ml，利福平50μg/ml，庆大霉素50μg/ml)中，28℃振荡培养过夜，待od600值为1.0-2.0，以5000rpm，室温离心10min，收集菌体；用200ml转化液(1/2ms，5％蔗糖，40μlsilwetl-77)悬浮菌体；将拟南芥花序浸泡在农杆菌的转化液中1min，套上保鲜袋保湿并置于黑暗处使其温度较低，第二天将植物从保鲜袋中取出，放回光照培养架上正常生长至收种。

pgwb17和pgwb5载体所带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素抗性对拟南芥转基因幼苗进行筛选，获得的t1代具有潮霉素抗性的阳性苗进行单株收种，再对t2代种子进行潮霉素抗性的测试，选择3/4具有抗性而其余1/4没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入。将这些株系中具有潮霉素抗性的植株移出，再进行单株收种，用获得的t3代种子再进行潮霉素抗性筛选，如果t4代植株没有分离，说明该转基因株系为纯合体，该纯合体可以用于繁种、低温逆境处理实验。

本实施例中分离得到过表达株系。采用蛋白质免疫印迹方法检测所得过表达株系。

1)提取植物总蛋白

将在培养皿上生长的12天幼苗用锡箔纸包好，迅速冻于液氮中备用。用液氮将植物材料磨成粉末状，加入蛋白提取缓冲液和蛋白酶抑制剂，涡旋震荡后于4℃，13000rpm离心15min。

2)蛋白质免疫印迹法(westernblot)检测过表达株系中的蛋白含量

分别取等量的野生型、过表达拟南芥株系的植物蛋白，加入5×sds蛋白上样缓冲液，100℃煮沸5min，90v电压跑胶15min后，改为120v电压跑胶1h，200ma直流电转膜2h。最后用anti-myc抗体检测过表达株系中的蛋白含量。以anti-actin作为内参。

westernblot检测结果见图1，a为转35s:myc2-myc拟南芥植株(oe-1)，b为转35s:myc2-gfp拟南芥植株(oe-2)，可以看出过表达株系中的目的蛋白表达较强。

在其它植物中过表达myc2基因的方法可以参考本实施例进行。

实施例3过表达myc2基因植物的耐低温能力检测

首先将野生型拟南芥幼苗和实施例2中所得的myc2基因过表达株系在培养皿上生长12天，然后将其移到低温培养箱内进行冷冻处理。对于冷驯化植物，过表达株系在培养皿上生长12天后移入4℃低温培养箱培养3天后，进行程序降温(1℃/小时)至所需零下低温处理一定时间。以上处理植株黑暗处理24小时后移入22℃光照培养箱培养3天后统计存活的植物数量，计算存活率。

结果显示(图2和图3)，在非冷驯化和冷驯化条件下，oe-1(35s:myc2-myc)和oe-2(35s:myc2-gfp)均表现抗冻的表型。这说明myc2过表达植株的耐低温能力得到显著提高。

由此可见，拟南芥myc2基因过表达后能够显著提高植物对低温的耐受能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>基因myc2在提高植物耐低温能力中的应用

<130>khp171116965.7

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>623

<212>prt

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>1

metthrasptyrargleuglnprothrmetasnleutrpthrthrasp

151015

aspasnalasermetmetglualaphemetserserseraspileser

202530

thrleutrpproproalaserthrthrthrthrthralathrthrglu

354045

thrthrprothrproalametgluileproalaglnalaglypheasn

505560

glngluthrleuglnglnargleuglnalaleuilegluglythrhis

65707580

gluglytrpthrtyralailephetrpglnprosertyrasppheser

859095

glyalaservalleuglytrpglyaspglytyrtyrlysglygluglu

100105110

asplysalaasnproargargargserserserpropropheserthr

115120125

proalaaspglnglutyrarglyslysvalleuarggluleuasnser

130135140

leuileserglyglyvalalaproseraspaspalavalaspgluglu

145150155160

valthraspthrglutrpphepheleuvalsermetthrglnserphe

165170175

alacysglyalaglyleualaglylysalaphealathrglyasnala

180185190

valtrpvalserglyseraspglnleuserglyserglycysgluarg

195200205

alalysglnglyglyvalpheglymethisthrilealacysilepro

210215220

seralaasnglyvalvalgluvalglyserthrgluproilearggln

225230235240

serseraspleuileasnlysvalargileleupheasnpheaspgly

245250255

glyalaglyaspleuserglyleuasntrpasnleuaspproaspgln

260265270

glygluasnaspprosermettrpileasnaspproileglythrpro

275280285

glyserasngluproglyasnglyalaproserserserserglnleu

290295300

pheserlysserileglnphegluasnglyserserserthrilethr

305310315320

gluasnproasnleuaspprothrproserprovalhisserglnthr

325330335

glnasnprolyspheasnasnthrpheserarggluleuasnpheser

340345350

thrserserserthrleuvallysproargserglygluileleuasn

355360365

pheglyaspgluglylysargserserglyasnproaspproserser

370375380

tyrserglyglnthrglnphegluasnlysarglysargsermetval

385390395400

leuasngluasplysvalleuserpheglyasplysthralaglyglu

405410415

serasphisseraspleuglualaservalvallysgluvalalaval

420425430

glulysargprolyslysargglyarglysproalaasnglyargglu

435440445

gluproleuasnhisvalglualagluargglnargargglulysleu

450455460

asnglnargphetyralaleuargalavalvalproasnvalserlys

465470475480

metasplysalaserleuleuglyaspalailealatyrileasnglu

485490495

leulysserlysvalvallysthrgluserglulysleuglnilelys

500505510

asnglnleuglugluvallysleugluleualaglyarglysalaser

515520525

alaserglyglyaspmetsersersercysserserilelysproval

530535540

glymetgluilegluvallysileileglytrpaspalametilearg

545550555560

valgluserserlysargasnhisproalaalaargleumetserala

565570575

leumetaspleugluleugluvalasnhisalasermetservalval

580585590

asnaspleumetileglnglnalathrvallysmetglypheargile

595600605

tyrthrglngluglnleuargalaserleuileserlysilegly

610615620

<210>2

<211>3289

<212>dna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>2

taagtaattaatctgttataaaaaatatattctaaaagttgacaaaacgacaaatataaa60

tcgaaaaaataggtgaaaagttatagtaaagtgtttttccactgagctcacagttcactc120

tttggtacaaaagaaacaatcagttaaaatctaagtcaatcattaaagagcgtgtgatac180

acgtgcgaccaaacagccgtacgatctcactcacttccggtcttaattcttaccgcgtcg240

atccaacagtcgatggggttaaatcgggatgtgagttcatcgaagcttctctctctctta300

caaccatccacgtttcccaatgaaatctcgccacgtaatatccctaacaacaaatttaca360

cattcaccctcaagatcagttacacatataataatcgcagacgctctccatttttctcca420

ctacgaagactttctcctatctctctctctctcattaaaaacgtgtttttttttaccggt480

caccggtttatggaatgactgattaccggctacaaccaacgatgaatctttggaccaccg540

acgacaacgcttctatgatggaagctttcatgagctcttccgatatctcaactttatggc600

ctccggcgtcgacgacaaccacgacggcgacgactgaaacaactccgacgccggcgatgg660

agattccggcacaggcgggatttaatcaagagactcttcagcaacgtttacaagctttga720

ttgaaggaacacacgaaggttggacctacgctatattctggcaaccgtcgtatgatttct780

ccggcgcctccgtgctcggatggggagatggttattacaaaggtgaagaagataaagcaa840

acccgagacggagatcgagttcgccgccgttttctactccggcggatcaggagtacagga900

aaaaagtgttgagagagcttaactcgttgatctccggtggtgttgctccgtcggatgacg960

ctgttgatgaggaggtgacggatacggaatggtttttcttggtttcgatgacgcagagct1020

tcgcttgcggtgcgggattagctggtaaagcgtttgcaacgggtaacgcggtttgggttt1080

ccgggtcagatcaattatccgggtcgggttgtgaacgggctaagcaaggaggagtgtttg1140

ggatgcatactattgcgtgtattccttcggcgaacggagttgtggaagtcgggtcaacgg1200

agccgatccgacagagttcggaccttattaacaaggttcgaattcttttcaatttcgacg1260

gcggagctggagatttatcgggtcttaattggaatcttgacccggatcaaggtgagaacg1320

acccgtctatgtggattaatgacccgattggaacacctggatctaacgaaccgggtaacg1380

gagctccaagttctagctcccagcttttttcaaagtctattcagtttgagaacggtagct1440

caagcacaataaccgaaaacccgaatctggatccgactccgagtccggttcattctcaga1500

cccagaatccgaaattcaataacactttctcccgagaacttaatttttcgacgtcaagtt1560

ctactttagtgaaaccaagatccggcgagatattaaacttcggcgatgaaggtaaacgaa1620

gctccggaaacccggatccaagttcttattcgggtcaaacacaattcgaaaacaaaagaa1680

agaggtcgatggttttgaacgaagataaagttctatcattcggagataaaaccgccggag1740

aatcagatcactccgatctagaagcttccgtcgtgaaagaagtagcagtagagaaacgtc1800

caaagaaacgaggaagaaagccagcaaacggtagagaagagccactaaaccacgtcgaag1860

cagagagacaaagacgcgagaaactaaaccaaagattctacgcgttacgagcggttgtac1920

caaacgtttcaaaaatggataaagcttcgttactcggtgacgcaatcgcttacatcaacg1980

agcttaaatccaaagtagtcaaaacagagtcagagaaactccaaatcaagaaccagctcg2040

aggaagtgaaactcgagctcgccggaagaaaagcgagtgctagtggaggagatatgtcgt2100

cttcgtgttcttcgattaaaccggtggggatggagattgaagtgaagataattggttggg2160

acgcaatgattagagttgaatctagtaagaggaatcatccggcggcgaggttgatgtcgg2220

cgttgatggatttggagttggaagtgaatcacgcgagtatgtcggtggttaacgatttga2280

tgattcaacaagcgacggtgaagatgggttttaggatctatacgcaagaacagctcagag2340

caagtttgatttcaaaaatcggttaaaagggtgtgttttgggaagtttagaaagttatgg2400

ggtcaaatcataattaattcgttttagtggcttcagtaattttgtagattttagttttgt2460

aagaaaaaaatcttaaaatagagcgacaagtttcttcttttgctctatgtttgagtctgt2520

atcgttttattgttgtatctcctcaatgagtaaacttgtatatattgatatgagtaatat2580

gagttagttactgaaaaagttaatatttctacacaatttcatatgataaaaaagaaaaag2640

aaatcgagtataaatggtctaaaataagagactaatggtcatgatcactgattttgtaca2700

tatggtcaaaaatgtctctcctaacacatcaaacttaggaagagagacaaatcttaagta2760

agttaagtcgagagggagaccatatgcacagttttcttaagtcagtgtgataatgtttcc2820

tcttgtctaatcaataagacacaacacacataaaccttagtataatactacatggatctt2880

cgaatacacagacagagtcacagacaagaaaaagcaaatcacttgcttttgtcttgatca2940

tttccaatatctacaaaaatagaaatcttgaagagattattgaatctgaaatctgctttg3000

tttgtgcattctcttcctcgatcacctcgcaagatcctctagcaacctgaccaatcctca3060

agaatcaagttttcttctttctagcttcagctttccaatctcgacgatgcggccttatct3120

tccgtttaaccgactcacaagaactatcttgagccttgttcataatcaaatgagctcttc3180

tagcttcttttttccaatttctatcgcaataaacccgccgcacaaagttctcaacataac3240

cactaggtccattaaactctagtccctcgtcttcttcttcttcttcttc3289

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caccatgactgattaccggctaca24

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

accgatttttgaaatcaaacttgc24