一株对植物病原真菌具拮抗作用的植物内生细菌的制作方法

本发明属于植物病害生物防治技术领域。更具体地，涉及一株对植物病原真菌具拮抗作用的植物内生细菌。

背景技术：

树木真菌病害是由病原性真菌引起的林木病害，如褐根病，是由有害木层孔菌（phellinusnoxius）引起经济作物、果树、古树名木和园林绿化植物等毁灭性破坏的土传病害，有“树癌”之称。目前主要采取砍除病树、掘沟阻断病原传播、熏蒸处理病土和种植无病苗木等防控措施，但是尚未有一种理想的防治药剂和防治方法能有效地控制树木褐根病的发生。另外，虽然目前有一些化学药剂可以有效地抑制褐根病菌，但是长期地应用化学农药，但成本高同时破坏土壤和生态环境。同时，近年来，随着人们对个人健康、食品安全以及生态环境的关注和重视，在农业生产中减少化学药剂，特别是传统高毒和高残留的化学农药的用量势在必行。生物防治是植物病害防治措施的首选和必然的趋势。

植物内生细菌的研究虽发展较晚，但目前利用植物内生菌进行植物病害的生物防治已经成为人们研究的热点。植物内生细菌是能够在健康植物组织和器官内定殖生活，但对植物不造成实质性的伤害，并能与植物形成互相约束、和谐联合、互惠互利的关系的一类微生物（istvanf,etal.,1995）。从早期的研究至20世纪90年代，据不完全文献统计，已经从将近30种植物中分离出近60个属的内生细菌，其中大约有2/3为革兰氏阴性细菌，所以在大多数高等植物中是普遍存在内生细菌这一类微生物群体（kobayashidy,etal.,1976）。内生细菌在植物体内长期生活的作用下，其对宿主植物具有有益的直接或者间接的生物促进作用。植物内生细菌的直接促生作用主要通过固氮作用、促进或者合成与植物相关联的生长激素、或者合成铁载体来协助宿主植物从土壤中吸收铁离子等方面（lazarovitsg,etal.,1997）。而对宿主植物的间接促生作用主要是指内生细菌可以通过与植物、与环境互相作用后，形成复杂的抗病机制来发挥植物病害防治因子的作用，从而减轻或阻止病害的发生等（sturzav,etal.,2000）。

植物内生细菌能与植物形成长期的合作关系，这从一定层面上可以说明内生细菌在植物中占据稳定的生态位，不易受到外界环境的影响，容易定殖植物体内的各个组织内部，从生防的角度来说，内生细菌这一稳定生态位的特性有利于内生细菌发挥生防作用的效果。另外，植物内生细菌存在多种防病作用机制，主要包括分泌抗菌活性物质、营养和生态位的竞争、增强植物的抗逆性和诱导植物系统抗性等。当植物组织内的内生细菌能够感知植物受到病原菌的伤害或者直接与病原菌产生作用，那么病原菌能够直接或间接地促使内生菌产生拮抗物质来抑制病原菌的生长或者减弱其致病力。从微生物的角度出发，内生细菌作为外源基因的载体，在不改变植物本身的天然性状的前提下，内生细菌可能可以偶然性地向植物体内转入外源杀虫和抗病基因，从而提高植物的抗病能力，发挥生防作用。

目前，尚未有应用内生细菌防治树木褐根病等真菌病害的报道，且细菌及其拮抗菌的对应选择也是生防内生细菌选择的一个重要的因素和指标。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有树木褐根病等真菌病害防治技术的缺陷和不足，提供一株源于万寿菊的内生菌拮抗细菌，该内生菌对树木褐根病等植物病原真菌具有显著的拮抗作用。

本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）菌株bsy3。

本发明另一目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3的培养工艺及粗提物。

本发明的再一目的是提供一种防治植物病害的解淀粉芽孢杆菌工程菌。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）菌株bsy3，该菌株于2017年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017463。

该菌株在lb培养基（酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，ph7.0）平板上菌落呈浅黄白色，近圆形，有褶皱，不透明。显微镜观察，菌株菌体杆状，产芽孢，无荚膜，革兰氏反应为阳性。

本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3的培养工艺，培养基配方比例为：葡萄糖或蔗糖8～12g，酵母提取物4～6g，蛋白胨5g，mgso4或mgcl24～6g，水定容至1l；ph为6～7；培养时间为36～50h。

优选地，最适培养基配方比例为：葡萄糖10g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，mgso45g，水定容至1l；ph为6.5；最适培养时间为48h。

该解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3是从草本植物万寿菊的叶片中分离所得，对褐根病菌、美人蕉瘟病菌、油菜菌核病菌、白蝴蝶炭疽病菌、黑松叶斑病菌以及香蕉枯萎病菌具有明显的拮抗作用，并在防治这些病原菌引起的真菌性病害具有一定的生防作用和潜在的应用价值。

因此，本发明还提供一种防治植物真菌病害的解淀粉芽孢杆菌粗提物，是将解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3培养36～50h后，发酵上清液经过滤膜获得；培养菌株bsy3所用培养基配方比例为：葡萄糖或蔗糖8～12g，酵母提取物4～6g，蛋白胨5g，mgso4或mgcl24～6g，水定容至1l；ph为6～7。

优选地，所述的解淀粉芽孢杆菌粗提物是将解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3培养48h后，发酵上清液过0.22μm滤膜获得；培养菌株bsy3所用培养基配方比例为：葡萄糖10g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，mgso45g，水定容至1l；ph为6.5。

优选地，所述植物真菌病害为褐根病菌、美人蕉瘟病菌、油菜菌核病菌、白蝴蝶炭疽病菌、黑松叶斑病菌和/或香蕉枯萎病菌引起的植物病害。

另外，还可以通过基因过程手段对本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3进行相应的改造，使其防治真菌性植物病害的作用更加显著，以及更加适用于工业应用。因此，以解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3为基础菌株改造得到防治植物病害的解淀粉芽孢杆菌工程菌，也应在本发明的保护范围之内。

具体地，所述改造可以是使其防治真菌性植物病害的作用更加显著和/或使其更加适用于工业应用的改造。

实验证明，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3可以作为一种植物病原真菌拮抗菌，对褐根病菌、美人蕉瘟病菌、油菜菌核病菌、白蝴蝶炭疽病菌、黑松叶斑病菌、香蕉枯萎病菌等6种病原真菌都有明显的拮抗作用，对这些真菌性病害具有很好的生防效果的应用潜力；尤其是可以很好地抑制褐根病菌的生长，为有“树癌”之称的褐根病提供一种新的具有应用潜力的防治方法。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3，其作为一种病原真菌拮抗菌，对常见的包括树木褐根病病菌在内的真菌性病害具有显著的防治效果，为树木褐根病等植物真菌病害的防治提供一种新的生物防治方法。

（2）该病原真菌拮抗菌bsy3来源于植物体内的内生细菌，相比传统的化学药剂防治法，对真菌性病害具有更加安全的生防效果。

（3）该病原真菌拮抗菌bsy3来源于植物体内的内生细菌，长期在植物体内，可与植物建立和谐共处、稳定发展的生存关系，与化学药剂相比，内生细菌可以更加有效地并稳定地发挥其生物防治的功能。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3对褐根病菌的拮抗作用。

图2为解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3的菌落形态。

图3为不同碳源对解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3生长及抑菌活性的影响。

图4为不同氮源对解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3生长及抑菌活性的影响。

图5为不同无机盐对解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3生长及抑菌活性的影响。

图6为不同ph对解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3生长及抑菌活性的影响。

图7为不同培养时间对解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3生长及抑菌活性的影响。

图8为解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3对6种常见病原真菌的拮抗作用。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3的分离与鉴定

1、从广州市白云苗圃采集的万寿菊植株中分离菌株，具体分离方法如下：

（1）单菌落分离

1）将采集到的新鲜的万寿菊叶片材料用自来水清洗干净；

2）用无菌水冲洗一遍之后，75%酒精浸泡5min，2%次氯酸钠溶液浸泡2min，再用无菌水冲洗4遍，将最后一次冲洗后的无菌水进行平板涂布作为空白对照；

3）将消毒过后的新鲜植物材料置于灭菌研钵内，加入少量无菌水研磨成匀浆后，稀释成不同梯度的研磨液分别平板涂布；

4）将平板置于30℃培养箱培养，观察菌落生长情况，再挑取不同形态的菌落，对目标菌株进行纯化培养，保存备用。

（2）将上述从万寿菊植株体内分离挑取出来并纯化培养的菌株，在2mllb培养基280rpm，30℃摇床中过夜培养。

在wa培养基平板上进行拮抗测试，完成拮抗菌的初筛实验，具体方法是：在wa培养基平板中央接入褐根病菌靶标菌，再将上述分离从万寿菊植株体内分离的内生细菌菌株接种于离靶标菌2cm处两侧，筛选出对靶标菌具有抑菌作用的菌株（结果如图1所示）。

其中，所述wa培养基的配方是：蛋白胨5g/l，葡萄糖10g/l，酵母提取物3g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l，ph6.8。

（3）对峙法复筛：用pda培养基对初筛所纯化的菌株进行复筛：

将纯化的菌株置于35mllb培养基250rpm，30℃摇床中过夜培养2天17小时，离心收集上清液，用0.22μm细菌过滤器过滤上清液。

用20mlpda与2ml过滤后的纯化菌株上清液混合倒盘，靶标菌菌块约4mm置于pda平板中央，每个处理3次，置于30℃培养箱培养，在第7天和第14天观察并记录对峙结果。

综上筛选得到一株对褐根病菌具有明显拮抗作用的内生细菌菌株，将该菌株命名为bsy3。

2、菌株鉴定

（1）形态鉴定

如图2所示，菌株bsy3在lb培养基平板上菌落呈浅黄白色，近圆形，有褶皱，不透明。显微镜观察，菌株bsy3的菌体呈杆状，产芽孢，无荚膜。革兰氏反应为阳性。

（2）菌株bsy3的生理生化实验

菌株bsy3的生理、生化等基本生物学特性如表1所示。

表1菌株bsy3的基本生物学特性

注：＋，阳性反应，或可以生长、利用；－，阴性反应，或不可以生长、利用。

（3）16srrna序列比对

经过克隆测序得到菌株bsy3的16srrna序列，并将其在ncbi网站上进行blast比对分析，得到与解淀粉芽孢杆菌16srrna的相似度达99%。

同时，综上所述其形态特征及生理生化特征与解淀粉芽孢杆菌也最相似，因此根据16srrna基因序列测定和形态特征、生理生化特性的综合结果来看，该菌株可以归为解淀粉芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）。

综上所述，本发明分离筛选得到一株对褐根病菌具有明显拮抗作用的内生细菌菌株，即解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3，并于2017年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017463，保藏地址为中国武汉大学。

实施例2解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3的最适培养条件优化

1、菌株生长的最适培养基

（1）优化方法：菌株bsy3在lb培养基上划线活化培养（30℃），再接种至lb液体培养基中，280rpm、30℃的条件下活化。将已活化的菌株bsy3按0.5%接种量接于摇瓶发酵基础培养基ygn[酵母提取物10g（不同氮源时），葡萄糖10g（不同碳源时），nacl5g（不同无机盐时），定容至1l，ph7.0]。接种后置于30℃、160rpm摇床中培养2～5天，然后将上述不同测定物质（碳源、氮源以及无机盐）的发酵液12000rpm离心15min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后即为原始发酵液，将原始发酵液与pda培养基按1:10的比例准备平板（9cm），用褐根病病原菌有害木层孔菌作为靶标真菌置于pda平板中央，当靶标真菌有害木层孔菌在对照pda平板上菌丝满盘的时间（day），来测定添加不同发酵液平板上靶标真菌的生长直径来反应抑菌活性，即不同营养源的培养对bsy3菌株抑菌活性的影响。以同等比例的lb液体培养基为空白对照，每个处理三个重复。

（2）最佳c源

如上方法，分别用1%可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖和玉米粉以及不加任何糖作为对照，等量替代基础培养基中的葡萄糖制成的培养基，将靶标菌置于平板中央，30℃培养箱中培养。结果表明（如图3），以葡萄糖和蔗糖为碳源时，菌株bsy3发酵滤液的抑菌活性最好。

（3）最佳n源

在基础发酵培养基分别用1%蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、黄豆粉、(nh4)2so4和nh4cl以及不加任何氮源作为对照，等量替代基础培养基中的酵母提取物制成的培养基，将靶标菌置于平板中央，30℃培养箱中培养。结果表明（如图4），以酵母提取粉和蛋白胨为氮源时，菌株bsy3发酵滤液的抑菌活性最好。

（4）最佳无机盐

在基础发酵培养基分别用0.5%的nacl、cuso4、cacl2、mgso4、zncl2、mgcl2和mnso4以及不加无机盐作为空白对照，等量替代基础培养基中的nacl制成的培养基，将靶标菌置于平板中央，30℃培养箱中培养。结果表明（如图5），以mgso4和mgcl2为无机盐时，菌株bsy3发酵液的抑菌活性最好。

综上所述结果表明，以葡萄糖和蔗糖为碳源时，其发酵滤液的抑菌活性最高；以酵母提取粉和蛋白胨为氮源时，其发酵滤液的抑菌活性最好；mgso4和mgcl2两种无机盐为最好。因此结合组分配比筛选结果显示，菌株bsy3的最适摇瓶发酵培养基组分为：葡萄糖10g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，mgso45g，定容至1l，初始ph值7.0。

2、菌株生长的最适ph值

供试菌株bsy3用最适液体培养基（葡萄糖10g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，mgso45g，定容至1l，初始ph分别为5.5～8.0）于30℃、160rpm摇床中培养2天，接种后置于30℃、160rpm摇床中培养2～5天后，将上述不同ph值（5.5～8.0）的发酵液12000rpm离心15min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后即为原始发酵液，将原始发酵液与pda培养基按1:10的比例准备平板（9cm），用褐根病病原菌有害木层孔菌作为靶标真菌置于pda平板中央，当靶标真菌有害木层孔菌在对照pda平板上菌丝满盘的时间（day），来测定不同ph值平板上靶标真菌的生长直径来反应抑菌活性。以pda培养基作为空白对照，每个处理3次重复。

结果表明（如图6），ph为6～7时抑菌效果差异不显著，ph为6.5时抑菌效果最好。ph超过7.5，抑菌活性明显下降。

3、菌株生长的最佳培养时间

供试生防菌bsy3用最佳液体培养基摇床培养（葡萄糖10g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，mgso45g，定容至1l，最适ph值6.5），于30℃、160rpm摇床培养24～120h，每隔24h取样，将上述不同时间（24～120h）的发酵液12000rpm离心15min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后即为原始发酵液，将原始发酵液与pda培养基按1:10的比例准备平板（9cm），用褐根病病原菌有害木层孔菌作为靶标真菌置于pda平板中央，当靶标真菌有害木层孔菌在对照pda平板上菌丝满盘的时间（day），来测定不同时间内平板上靶标真菌的生长直径来反应抑菌活性。以pda培养基作为空白对照，每个处理3次重复。

结果表明（如图7），培养48h抑菌活性已经达到最好效果，延长发酵时间不能显著增强抑菌活性。

实施例3解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3对常见病原真菌的拮抗作用检测

1、将bsy3菌株分别与几种病原真菌共同培养，检测其对病原真菌的拮抗作用。

供试菌株：有害木层孔菌（p.noxius）、白蝴蝶炭疽病病原菌（colletotrichumsp.）、美人蕉瘟病病原菌（pyriculariacannaecola）、黑松叶斑病病原菌（pestalotiopsissp.）、香蕉枯萎病病原菌（fusariumoxysporumf.sp.cubense）和油菜菌核病病原菌（sclerotiniasclerotiorum）。

2、对峙培养检测法：

（1）将菌液1%(v/v)比例接种于装有40mllb培养基的150ml三角瓶中，28℃、200rpm培养2.5天；

（2）8000rpm离心10min收集上清液，然后过0.22μm的滤膜获得粗提物；

（3）取1ml粗提物混合9mlpda培养基制备生测平板，以仅添加相同量的lb培养基作为对照组，在第7d和14d时测量菌落的直径，按照下式计算相对抑菌率，实验重复3次：

相对抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

3、结果如表2和图8所示

表2菌株bsy3对6种病原真菌的拮抗作用

结果表明，本发明筛选获得的这株解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3对常见病原真菌具有很强的拮抗作用，抑制真菌性病害的病原菌的生长，对该真菌性病害具有明显的生物防治的效果。

4、另外，还可以通过基因过程手段对本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株bsy3进行相应的改造，使其防治真菌性植物病害的作用更加显著，以及更加适用于工业应用。