羰基还原酶突变体、载体、工程菌及其应用的制作方法

文档序号：13465943阅读：194来源：国知局

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌羰基还原酶突变体、基因以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及含有该酶的重组细胞在不对称还原一系列潜手性酮制备光学纯手性醇中的应用。

背景技术：

手性药物的两种对映异构体往往具有不同的功效或其作用效果相差甚远，因此，单一对映体的合成越来越受关注。作为最重要的手性砌块之一，光学活性手性醇被广泛应用于手性药物和精细化学品的合成之中。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法，理论上能将100％的底物酮转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价值。

与化学法不对称还原相比，生物催化法在化学选择性、区域选择性和立体选择性方面更具优势，产物光学纯度高；此外，生物催化潜手性酮不对称还原合成手性醇因具有理论产率高、选择性好、副产物少喝反应条件温和等优点而成为手性醇绿色合成的优选途径。羰基还原酶催化潜手性酮还原制备高光学纯度手性醇已有诸多报道。但是，大多数羰基还原酶的催化活性远不能满足工业化生产要求，目前应用于工业化的还原酶类催化剂所占比例尚不足总量20％，如何针对特定底物找到具有高催化活性和选择性的生物催化剂是该领域至关重要的问题。将生物信息学、基因重组和蛋白质工程相结合，快速高效开发性能优越的新型生物催化剂是发展生物不对称还原技术的有效途径。一些来自枯草芽孢杆菌的还原酶结构和性质已有研究报道，如羰基还原酶yued对联苯甲酰有还原活性(j.biotechnol。，2002,96:157-169)，还可催化多种芳基酮不对称还原生成光学活性手性醇(bioresour。technol。，2010,101).但是以野生型作为催化剂时酶产量低、催化底物浓度低、催化效率不高，限制了此羰基还原酶在工业上的应用。

技术实现要素：

本发明目的是通过定向进化手段对枯草芽孢杆菌羰基还原酶进行改造，提供酶活提高的羰基还原酶yued的突变体及其重组工程等，为手性醇的合成提供强有力的生物催化剂。

本发明采用的技术方案是：本发明根据genbank中收录的枯草芽孢杆菌bacillussubtilis(strain168)的还原酶yued基因序列设计合成引物，成功克隆了编码yued酶的基因，转化于大肠杆菌e.colibl21(de3)后进行了该基因的表达。进一步使用多轮易错pcr方法对yued酶基因进行随机突变，连接于表达载体后，同样表达于大肠杆菌，通过筛选获得活力提高的突变体，能够用于手性醇合成的工业化生产。

本发明第一方面提供一种催化活性显著提高的枯草芽孢杆菌羰基还原酶yued突变体(即yued突变体)，这些突变体是在seqidno.2所示羰基还原酶yued氨基酸序列上进行构建，该羰基还原酶核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示。所述突变体是在seqidno.2所示羰基还原酶yued氨基酸序列基础上含有如下几个位点的单点突变或多点组合突变：135位甘氨酸、181位缬氨酸、190位异亮氨酸、203位精氨酸。

优选地，所述突变体是分别在羰基还原酶yued的153位甘氨酸和181位缬氨酸两个位点进行取代，且更优选的，上述两个优选点同时进行取代时催化活性更好。

优选地，所述突变体分别为：将羰基还原酶yued的153位甘氨酸突变为组氨酸，如seqidno.4所示；将181位缬氨酸突变为丙氨酸，如seqidno.6所示；且上述两个位点突变的组合突变体具有更优的催化活性，如seqidno.8所示。

任何对上述所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的，仍属于本发明的保护范围。

本发明的第二方面提供一种所述枯草芽孢杆菌羰基还原酶yued突变体的编码基因，其中突变体g135h核苷酸序列如序列表中seqidno.3所示，其编码的氨基酸序列如序列表seqidno.4所示；突变体v181a核苷酸序列如序列表中seqidno.5所示，其编码的氨基酸序列如序列表seqidno.6所示；突变体g135h/v181a核苷酸序列如序列表中seqidno.7所示，其编码的氨基酸序列如序列表seqidno.8所示。

本发明的第三方面提供一种包含本发明的羰基还原酶突变体基因的核苷酸序列的重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的羰基还原酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pet-30a。

本发明的第四方面提供一种表达重组羰基还原酶突变体的基因工程菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的羰基还原酶突变体基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选为大肠杆菌e.colibl21(de3)。

本发明的第五方面提供一种重组羰基还原酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组羰基还原酶突变体蛋白。其中，所述的培养基重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的羰基还原酶突变体蛋白的培养基，优选lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生羰基还原酶突变体蛋白即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的lb培养基中培养，当培养液的光密度od600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)的诱导下，即可高效表达本发明的重组羰基还原酶突变体蛋白。

本发明提供的yued突变体可以以游离酶、固定化酶以及重组游离细胞的形式催化合成光学活性手性醇。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：

(1)斜面培养：将含枯草芽孢杆菌羰基还原酶yued突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养8-16h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，ph7.0。使用前加入50μg/ml卡那霉素。

(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，50μg/ml卡那霉素，溶剂为去离子水，ph7.0。

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种至无菌的装有18l发酵培养基的30l机械搅拌通风通用式发酵罐中，37℃发酵培养14h后将已灭菌的终浓度为15g/l乳糖分批添加到发酵罐中于26℃下诱导培养。待培养12～24h后od600达到100-150放罐收集湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨15g/l，酵母粉12g/l，nacl10g/l，甘油15g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po41.36g/l，k2hpo4·3h2o2.28g/l，mgso4·7h2o0.375g/l，溶剂为去离子水。

本发明的第六方面提供所述羰基还原酶突变体或其基因工程菌在不对称催化潜手性酮制备的应用。

具体的，所述的应用为：以潜手性酮为底物，加入上述突变体或基因工程菌，以nadh或nadph为辅酶，20～50℃下，于ph5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。

其中，r1和r2为氢、烷基、卤代烷基、卤素、烷氧基和硝基。

具体的r1和r2可以为-h,-ch3，-ch2ch3，-ch2ch2ch3，-ch2x,-cx3，-x,-och3，-och2ch3；x代表f,cl,br,oh,no2。

所述的反应条件可按本领域所用的常规条件进行选择。

进一步，所述转化体系中底物初始浓度为10～1000mmol/l。

进一步，所述反应体系中菌体的质量用量以菌体湿重计为10～500g/l。

进一步，所述体系中还包括有机溶剂。

进一步，所述有机共溶剂为二甲亚砜、异丙醇、甲醇中的一种或多种，优选的为二甲亚砜，反应体系中二甲亚砜的浓度为10％。

进一步，反应体系还可添加醇或糖作为辅底物，可以显著提高反应的活力和立体选择性。所述辅底物醇或糖的质量分数为反应体系总质量的1～15％。

进一步，反应体系中的辅底物为木糖。

进一步，反应体系中木糖的质量分数为反应体系总质量的10％。

进一步，所述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，将转化反应液离心，取上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性醇的粗品，将粗品提纯即获得相应手性醇。所述粗品提纯的方法为本领域公知技术，通常为有机溶剂萃取、色谱分离和吸附分离等。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：本发明所提供的枯草芽孢杆菌羰基还原酶yued突变体与野生型相比较，具有更优良的催化活性，yued突变体催化合成手性醇的浓度在100～300g/l，转化率达70％～99.9％，产率70％～98％，光学纯度大于99％，具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1为羰基还原酶yued及其突变体分离纯化后sds-page图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：突变体的构建

以含有突变点的寡核苷酸片段为引物(表1)，采用quickchangetm方法(stratagene,lajolla,ca)扩增含有羰基还原酶基因的pet-30a重组质粒。

表1突变体构建引物

^a下划线标示为突变位点

pcr反应体系：5×primerstarbuffer(mg²⁺plus)，5μl；dntps(各2.5mm)，2.0μl；上游引物(10μm),1.0μl；下游引物(10μm),1.0μl；重组质粒模板，15ng；primerstarpolymerasetmhs(2.5u/μl)，0.5μl；加ddh2o至总体积为25μl。

pcr程序：(1)98℃，1min；(2)98℃，10s；(3)55℃，10s；(4)72℃，7min。步骤(2)-(4)循环20次后冷却至4℃。

pcr产物经清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶dpnⅰ进行消化以降解模板质粒。酶切反应体系及条件：17μl经清洗处理的pcr产物，2.0μl10×缓冲液，1.0μl限制性内切酶dpnⅰ，37℃保温1h。

将上述经酶切处理的pcr产物转化至大肠杆菌bl21(de3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布与含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落pcr鉴定和测序验证，结果表明含有羰基还原酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主e.colibl21(de3)中。最终获得突变体g135h、v181a和g135h/v181a。核苷酸序列测序结果分别如序列表中seqidno.3、seqidno.5和seqidno.7所示，相应编码蛋白质氨基酸序列如序列表中seqidno.4、seqidno.6和seqidno.8所示。

图1为羰基还原酶yued及其突变体分离纯化后sds-page图。其中lane1,marker；lane2,yued；lane3,g135h；lane4,v181a；5,i190n；lane6,r203l。

实施例2：羰基还原酶突变体的诱导表达

实施例1构建的工程菌接种至50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度od600至0.6左右，加入终浓度为0.1mm的iptg，26℃诱导培养6h后，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，-80℃储存备用。

实施例3：羰基还原酶突变体的发酵罐培养

实施例1构建的工程菌接种至50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以2％接种量(v/v)接种至含50μg/ml卡那霉素的培养基中，37℃，200rpm培养，在对数中期时以10％接种量(v/v)接种至含15l50μg/ml卡那霉素的发酵培养基的发酵罐中，37℃，培养14h左右(对数中后期)，加入乳糖进行诱导20h后，利用管式离心机离心收集菌体备用。

实施例3中所用发酵培养基为本领域所熟知的可使突变体生长并产生本发明羰基还原酶突变体蛋白的培养基。

实施例4：yued及其突变体g135h/v181a重组细胞催化活性

反应体系(10.0ml)：3g实施例3中的湿菌体细胞，500mm不同底物，1.0ml二甲亚砜，1.2g木糖，9.0mlna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm,ph7.0)。于35℃，200rpm条件下反应。实验结果如表2所示。

表2实施例4中催化500mm浓度不同底物不对称还原反应结果

实施例5：羰基还原酶yued及突变体g135h/v181a转化高浓度3-溴苯乙酮

反应体系(10.0ml)：3g实施例3中的湿菌体细胞，不同浓度3-溴苯乙酮，1.0ml二甲亚砜，1.2g木糖，9.0mlna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm,ph7.0)。于35℃，200rpm条件下反应。yued重组大肠杆菌全细胞催化明显低于突变体g135h/v181a，反应2h、6h、20hyued重组细胞产率分别为8％、21.8％、32.9％，且ee值只有95％；突变体g135h/v181a重组细胞产率分别为59％、76％.5、88.2％，且ee值高达99％；当底物浓度达到500mm时，该g135h/v181a突变体全细胞仍能有效催化反应进行，反应24h后，产率达到88％。具体实验结果如表3所示。

表3实施例5中催化不同底物(3-溴苯乙酮)浓度不对称还原结果

实施例6：羰基还原酶突变体g135h/v181a放大反应体系转化高浓度3-溴苯乙酮

反应体系(100l)：30kg实施例3中的湿菌体细胞，不同浓度3-溴苯乙酮，10l二甲亚砜，12kg木糖，90lna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm,ph7.0)。于35℃，400rpm条件下反应。当底物浓度达到500mm时，该突变体全细胞仍能有效催化反应进行，反应24h后，产率达到83％，已具有很好的产业化开发前景。

序列表

<110>杭州馨海生物科技有限公司

<120>羰基还原酶突变体、载体、工程菌及其应用

<130>2017

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<212>dna

<213>人工序列()

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aaaaaactaacgcagcatcaaatagacctcatcaatcttgaagaagctggacagcaattt180

gaaacattgctctcatccatcgatccagatcgttattctggtattacccttatcaataac240

gccggaatggtaacgccgatcaaacgtgccggcgaagcgtctcttgacgagcttcagcgc300

cattatcagctgaacctgactgcgcccgtgcttttgagtcagctgtttacaaaacggttt360

gcttcatacagcggcaaaaagacggttgttaacattacttcaggagccgccaaaaatcca420

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ttcggatttgaacaggaggatgaagagctgccggtgaacatgatttcgttttcacctgga540

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<210>2

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<213>人工序列()

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151015

valalaleuglnalaleuglulysglyhisgluvalhisalaleuser

202530

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354045

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65707580

alaglymetvalthrproilelysargalaglyglualaserleuasp

859095

gluleuglnarghistyrglnleuasnleuthralaprovalleuleu

100105110

serglnleuphethrlysargphealasertyrserglylyslysthr

115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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195200205

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210215220

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