一种重组新城疫病毒的构建方法及应用与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种重组新城疫病毒的构建方法及应用。

背景技术：

癌症是引起人类死亡的重要原因之一。因为前期缺乏特异性的观测指标，所以人们往往不能及时发现和治疗，从而错过了最佳治疗时间。另外，对于肿瘤的治疗往往也缺乏有效的药物和治疗手段。随着研究的深入，溶瘤病毒治疗吸引越来越多研究者的关注。溶瘤病毒能够增强肿瘤相关抗原的表达，引起肿瘤特异性免疫反应。新城疫病毒作为溶瘤病毒家族中的一员也逐渐被人们认识和研究。

新城疫病毒（ndv）为副粘病毒科、腮腺炎病毒属的单股负链rna病毒，核酸长度为15186bp,核酸序列为3’-np-p-m-f-hn-l-5’，每一个基因都有独立的基因起始区（gs）、基因终止区(ge)和基因间序列（ig）。根据对鸟类致病力不同可以将病毒分为三种：强毒株、中强毒株、弱毒株。新城疫病毒的致病性通常被认为由f基因所决定。f基因产生的f蛋白以f0融合蛋白形式存在，只有经胰蛋白酶作用后才具有重新感染细胞的能力。新城疫病毒感染人体后，不依赖于人体细胞分裂能够独立复制，并且不会将基因组整合到人的基因组中。另外，新城疫病毒能够诱导肿瘤细胞凋亡，而对人体正常细胞无明显毒副作用。虽然中强毒株对肿瘤的杀伤作用更强，但是考虑到保存和利用的不恰当，流落到自然界，会给鸟类和家禽业带来重大损失。并且中强毒株对正常细胞的杀伤作用也远高于弱毒株。考虑到以上方面，弱毒株组lasota将作为溶瘤药物的很好选择。

干扰素γ诱导蛋白10（ip10/cxcl10）是一种分子量为10kda的细胞因子，为cxc趋化家族的一员。通过与cxcr3配体结合，能够趋化nk细胞，活化cd4⁺t细胞和cd8⁺t细胞等。它由活化的t细胞、单核细胞、nk等细胞分泌。它能够通过趋化细胞毒性t细胞杀伤肿瘤细胞。并且，ip10具体抑制血管生成的作用，它能够独自或与其它药物共同作用治疗肿瘤。

随着反向遗传学技术的迅速发展，将新城疫病毒与免疫治疗相结合提供了可能。在本研究中，我们将具有肿瘤选择性的新城疫病毒lasota和具有趋化免疫细胞的ip10基因序列进行重组，利用反向遗传学技术拯救出重组病毒rndv-ip10。并且，验证了重组病毒的生长动力学和ip10基因的表达，为以后的研究建立基础。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种重组新城疫病毒及其应用。

本发明的另一目的是提供该重组新城疫病毒的构建方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述的重组新城疫病毒含有如seqidno：1所示的dna序列。

进一步地，所述的重组新城疫病毒dna包括由于插入、缺失或突变导致的与seqidno：1同源性超过90%以上的衍生dna序列。

进一步地，重组新城疫病毒的构建方法包括构建携带ip10基因质粒、重组病毒的拯救和病毒生长，具体构建步骤如下：

(1)构建携带ip10基因质粒：使用限制性内切酶酶切开pbrn-fl-pmeⅰ载体中p和m基因间的pmeⅰ位点，使用上游引物和下游引物通过pcr扩增出携带gn和ge片段的ip10基因，然后使用胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将纯化的产物用重组酶克隆入pbrn-fl-pmeⅰ载体中，构建出携带ip10基因的质粒，命名为pbrn-fl-ip10；

(2)重组病毒的拯救：将bsr-7细胞铺于六孔板中，待细胞长满六孔板约80%时，将5μg的pbrn-fl-ip10质粒和2.5μg的pbs-np质粒、1.25μg的pbs-p质粒和1.25μg的pbs-l质粒共转染入bsr-7细胞；12小时后用10%的dmso休克细胞2.5min，用1×pbs溶液洗一次，然后加入完全培养基；24小时后换成opti-mem并加入tpck，将细胞放入培养箱中培养3天后，刮取细胞用0.25μm过滤器过滤，滤液注入9~11日龄的spf鸡胚尿囊腔中；注射后的鸡胚在孵化箱中继续孵育5天后，抽取鸡胚尿囊液50μl，用1%鸡红细胞测病毒效价，收取效价阳性鸡胚尿囊液，即rndv-ip10，放入-80℃保存；

(3)病毒生长：将rndv-ip10以moi=0.01感染24孔板中的cef细胞一小时后，去除病毒稀释液，随后加入10%fbs的dmem继续培养，每隔24小时收集细胞培养液，将收集到的培养液再次感染cef细胞。

进一步地，所述的上游引物序列如seqidno：2所示，所述的下游引物序列如seqidno：3所示。

进一步地，所述的重组酶为重组酶exnasetmii。

进一步地，所述的步骤（2）加入tpck的浓度为1μg/ml。

进一步地，所述的步骤（2）spf鸡胚尿囊腔中浓度为400μl/枚。

进一步地，根据以上所述dna序列拯救出的重组新城疫病毒。

进一步地，根据以上所述的重组新城疫病毒在治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

首先，溶瘤病毒对人体的安全性需要被考虑。新城疫病毒对ⅰ型干扰素比较敏感，而许多肿瘤细胞缺乏干扰素信号转导通路，所以致使新城疫病毒能在肿瘤细胞中复制而不能在正常细胞中生长。另外，肿瘤细胞也缺乏相应的抗病毒信号通路。数据表明，新城疫病毒在肿瘤细胞中的复制能力是正常细胞的10000倍，并且不具有嗜神经性。临床结果表明，即使当人体感染新城疫病毒后也仅表现出轻微流感样病理反应，而没有其它严重的病理反应。根据以上特性说明它被作为药物具有人们所注重的安全性。另外，新城疫病毒可刺激机体的免疫功能，通过诱导细胞毒性t细胞、nk细胞、单核细胞等来增强机体的抗瘤作用。虽然部分新城疫病毒株被用于临床，并取得一定的疗效，但是它的溶瘤疗效仍然需要被提高。随着反向遗传学技术成熟，研究者正通过对新城疫病毒基因改造来增强溶瘤效果。将外源基因——il2、il15、ns1等插入到新城疫病毒基因中发现，外源基因的插入不会影响病毒的复制，并且目的基因能够正常表达。更重要的是，重组新城疫病毒对肿瘤细胞的选择性杀伤作用没有改变，并增强了对肿瘤细胞的杀伤作用。重组新城疫病毒明显抑制了肿瘤的生长和延长了小鼠的生存时间。

本发明突出的实质性进步和显著的特点是：

ip10通过与cxcr3配体结合定向趋化cd4⁺t、cd8⁺t、nk细胞等抑制肿瘤。并且能够与其它基因或是药物联合治疗肿瘤，明显延长了动物生存时间和抑制了肿瘤血管的生成。本研究中，我们通过反向遗传技术将ip10序列插入到新城疫病毒基因组中。最终成功构建出了表达ip10蛋白的rndv-ip10，为以后探究rndv-ip10的联合抗瘤作用奠定基础。

附图说明

图1是实施例2构建携带ip10基因的重组ndv-ip10病毒示意图；图中显示在新城疫病毒p和m基因间的pmeⅰ位点插入ip10基因；其中，白色方格代表基因起始序列，黑色方格代表基因终止序列。

图2是实施例2ndv-ip10和ndv病毒在cef细胞中的生长曲线示意图。

图3是实施例2目的基因ip10的间接免疫荧光结果。

图4是实施例2重组病毒ndv-ip10和ndvwesternblot检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

1、材料和方法

细胞和质粒

能稳定表达t7rna聚合酶的bsr-7细胞、原代鸡胚成纤维细胞（cef细胞）和乳仓鼠肾细胞（bhk-21细胞）均用10%fbs的dmem培养，生长环境为37℃和5%co2。使用弱毒株lasota作为重组病毒的载体。重组新城疫病毒基因组转录载体pbrn-fl-pmeⅰ及辅助质粒pbs-np、pbs-p和pbs-l以上质粒和细胞均有哈尔滨兽医研究所提供。mhcc-97l细胞为本实验室保存，使用含10%fbs的高糖dmem培养。ip10的编码基因序列由长沙优宝生物科技有限公司合成，由pmd18-t载体携带。spf鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

试剂

重组酶exnasetmii、taq酶及限制性内切酶均购自vazyme公司。磷酸钙试剂盒购自invitrogen。小鼠抗人ip10抗体购自abcam公司。小鼠抗人β-actin抗体购自武汉三鹰公司。fitc标记山羊抗鼠抗体购自sigma公司。携带igg-hrp标记的山羊抗小鼠抗体购自北京全式金有限公司。ecl超敏化学发光检测试剂盒购自索莱宝公司。荧光显微镜购自奥林巴斯公司。

构建携带ip10基因质粒

使用限制性内切酶切开pbrn-fl-pmeⅰ载体中p和m基因间的pmeⅰ位点。使用上游引物（5’-aggtccaactctgtttaaacttagaaaaaatacgggtagaagtgccaccatgaatcaaactgccattctg-3’）和下游引物（5’-attgccgcttgggtttaaacttaaggagatcttttagacctttcc-3’）通过pcr扩增出携带基因起始序列（gn）和基因终止序列（ge）的ip10基因序列。然后使用胶回收试剂盒纯化目的基因片段。将纯化的产物用重组酶克隆入pbrn-fl-pmeⅰ载体中，构建出携带ip10基因的质粒。对构建的质粒进行测序，挑选出正确质粒命名为pbrn-fl-ip10。

重组病毒的拯救

将bsr-7细胞铺于六孔板中，待细胞长满六孔板约80%时，将5μg的pbrn-fl-ip10质粒和2.5μg的pbs-np质粒、1.25μg的pbs-p质粒和1.25μg的pbs-l质粒共转染入bsr-7细胞。12小时后用10%的dmso休克细胞2.5min，用1×pbs溶液洗一次，然后加入完全培养基。24小时后换成opti-mem并加入tpck(1μg/ml)。将细胞放入细胞培养箱继续培养。3天后刮取细胞，将混合液使用0.25μm过滤器过滤。滤液注入9~11日龄的spf鸡胚尿囊腔中（400μl/枚）。注射后的鸡胚在孵化箱中继续孵育5天。随后抽取鸡胚尿囊液50μl，用1%鸡红细胞测病毒效价。收取效价阳性鸡胚尿囊液，放入-80℃保存。

病毒生长曲线

使用cef细胞检测病毒的生长动力学。简而言之，将ndv和rndv-ip10以moi=0.01感染24孔板中的cef细胞一小时后，去除病毒稀释液，随后加入10%fbs的dmem继续培养。每隔24小时收集细胞培养液，将收集到的培养液再次感染cef细胞。病毒滴度使用终点滴定检测和50%组织细胞感染量（tcid50）计算。

间接免疫荧光

将ndv和rndv-ip10以moi=0.0001感染bhk-21细胞1小时，随后去除病毒稀释液换成含10%fbs培养基继续培养24小时。弃掉培养液，用1×pbst洗两次；4%的多聚甲醛室温固定15min。弃掉固定液，随后用1×pbst洗三遍，每次五分钟。含1%的bsa溶液室温封闭1小时。小鼠抗人ip10抗体室温孵育1小时；弃掉抗体稀释液，用1×pbst洗三次，每次5min；使用fitc标记山羊抗鼠抗体避光孵育30min。1×pbst洗三次，每次5min。最后使用荧光显微镜观察荧光。

分别用ndv和rndv-ip10以mo=0.1感染mhcc-97l细胞1h，随后加入含10%fb的高糖dmem继续培养，36h后收获细胞。冰上裂解细胞30min后12000×g离心15min，收取上清。将样品用12%sds-page分离，然后将凝胶中的样品通过湿转法转移到0.2μm的pvdf膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1小时。小鼠抗人ip10特异性抗体和小鼠抗人β-actin特异性抗体4℃孵育过夜。tbst洗膜，使用辣根过氧化物酶（hrp）标记山羊抗小鼠抗体孵育1小时。tbst洗膜，用ecl发光液浸泡后扫膜。

实施例2

2结果

重组病毒ndv-ip10的产生

ip10基因序列插入到重组病毒质粒的p和m基因间（图1），将重组质粒命名为pbrn-fl-ip10。重组质粒pbrn-fl-ip10和pbs-np、pbs-p和pbs-l共转染入bsr-7细胞，拯救出重组病毒rndv-ip10。然后将收集到的培养液注入9~11日龄鸡胚尿囊腔中扩增，5天后收取尿囊液测得血凝效价滴度约为1：256，收取阳性尿囊液。

重组病毒生长特征

为了探究外源基因的插入是否影响重组病毒的生长，我们使用cef细胞测定病毒的生长特征。利用无外源基因的亲本ndv作为对照组。如图2所示，两种病毒的生长特征基本相同，约在72h时滴度最高。结果证明，插入外源基因的rndv-ip10在cef细胞中能够如亲本一样正常生长复制。

间接免疫荧光

为了验证重组病毒rndv-ip10能够成功表达外源基因ip10，采用间接免疫荧光技术来追踪目的基因。如图3所示，感染了rndv-ip10的bhk细胞能够表达ip10蛋白，而感染了亲本ndv的细胞未能表达ip10。结果证明，重组病毒ndv-ip10能够成功表达ip10基因。

重组ndv-ip10在mhcc-97l细胞中的表达

为了验证rndv-ip10能否在肿瘤细胞中正常表达ip10基因,我们使用westernblot检测ip10蛋白的表达。根据图4所示，感染了rndv-i10的细胞蛋白样品有特异条带，而感染了ndv的样品没有出现条带。由此可以得出结论，rndv-ip10可以在肝癌细胞中成功表达ip10基因。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。

序列表

<110>广西医科大学

<120>一种重组新城疫病毒的构建方法及应用

<130>2017

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>15528

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequencelatin)

<220>

<221>misc_feature

<223>对人工序列的描述：构建重组新城疫病毒的dna序列

<400>1

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<220>

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<223>对人工序列的描述：上游引物ndv-f-f序列

<400>2

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<210>3

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequencelatin)

<220>

<221>misc_feature

<223>对人工序列的描述：下游引物ndv-f-r序列

<400>3

attgccgcttgggtttaaacttaaggagatcttttagacctttcc45