本发明属于医药技术领域，涉及一种地加瑞克的纯化方法，具体而言涉及一种碱性酸式盐或弱碱去除地加瑞克中三氟乙酸的方法。
背景技术：
三氟乙酸(trifluoroaceticacid，tfa)是多肽固相合成中fmoc(9-芴甲氧羰基)保护策略中常用的裂解试剂，也是多肽纯化过程中流动相中常用的离子对试剂。三氟乙酸的酸性较强，一般与多肽结合成盐存在。但如果是用于临床前和临床研究中的多肽，残留的三氟乙酸或氟化物对人体是有毒的，必须通过脱盐或转化成醋酸盐去除。
地加瑞克(degarelix)是由ferringpharmaceuticals公司开发(tradename:firmagon)的一种含有7个非天然氨基酸的线性十肽，用于治疗晚期前列腺癌。地加瑞克的合成工艺主要为固相合成方法，固相合成的树脂肽通过三氟乙酸裂解得到粗肽。目前文献报道固相合成多肽纯化多采用反相色谱，离子交换色谱等色谱方法，cn102428097a、cn102329373a以及cn103992378均采用fomc策略合成地加瑞克，经三氟乙酸裂解后得到的多肽粗品溶于水后，进行了两次c18柱纯化和一次c18柱脱盐以除去三氟乙酸。由于裂解过程中三氟乙酸用量大，粗肽中三氟乙酸含量较高，其水溶液酸性较强，反相c18柱纯化过程中，对填料损害大，降低填料寿命和柱效，影响纯化工艺的稳定性。同时，柱层析纯化需要用到大量含乙腈等有毒试剂作为流动相，处理耗时长，需要三次柱层析才能去除肽类杂质，不适于企业大规模生产，更会造成原料和试剂的浪费，若采用向含三氟乙酸的地加瑞克的水溶液中加碱沉淀地加瑞克，易导致体系形成果冻状物，无法过滤，这使其无法在工业上大规模应用，因此，如何获得一种操作简便、成本低廉、绿色环保的除去三氟乙酸的方法成为亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明提供了一种地加瑞克的纯化方法，包括：
(1)含有三氟乙酸的地加瑞克在碱性酸式盐或弱碱的存在下，在醇类溶剂和水的混合溶剂中进行反应；
(2)分离固体。
在一些实施方案中，所述含有三氟乙酸的地加瑞克中三氟乙酸的质量分数为0.5％～60％，优选为5％～50％，更优选为10％～30％，进一步优选为15％～25％，最优选为18％～20％；在本申请的一些具体实施方案中，所述含有三氟乙酸的地加瑞克中三氟乙酸的质量分数为19.9％。
在一些实施方案中，所述步骤(1)的碱性酸式盐为碱金属类碱性酸式盐，可选自碱金属类碳酸盐、碱金属类碳酸氢盐、碱金属类磷酸盐或碱金属类磷酸氢盐的一种或一种以上，优选为碱金属类碳酸盐或碳酸氢盐的一种或两种，更优选为碱金属类碳酸氢盐。所述碱金属选自锂、钠或钾，优选为钠或钾，更优选为钠。
在一些实施方案中，所述步骤(1)的碱性酸式盐选自碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸氢二钠的一种或一种以上，优选为碳酸钠或碳酸氢钠的一种或两种，更优地为碳酸氢钠。
在一些实施方案中，所述步骤(1)的弱碱选自三乙胺或氨的一种或两种。
在一些实施方案中，所述步骤(1)的醇类溶剂选自甲醇、乙醇或异丙醇中的一种或一种以上，优选为甲醇或乙醇的一种或两种，更优地为甲醇。
在一些实施方案中，所述步骤(1)的醇类溶剂和水体积比为2.5～30:1，优选为3～25:1，更优选为4～15:1，最优选为5～10:1。
在一些具体实施方案中，所述步骤(1)的醇类溶剂和水体积比约为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、15:1、20:1或25:1，优选约为5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1，更优选约为5:1或10:1，最优选约为5:1。
在一些实施方案中，其中以kg/l计，所述步骤(1)的含有三氟乙酸的地加瑞克和水的比例约为0.05～2.00:1，优选为0.10～1.00:1，更优选为0.20～0.50:1，最优选为0.26～0.30:1或者0.50:1。
在一些实施方案中，其中以kg/l/l计，所述步骤(1)的含有三氟乙酸的地加瑞克、醇类溶剂和水的比例为0.05～2.00:2～30:1，优选为0.10～1.00:3～25:1，更优选为0.20～0.50:4～15:1，最优选为0.26～0.30:5～10:1或者0.50:5～10:1。
在一些实施方案中，其中以kg/l/l计，所述步骤(1)的含有三氟乙酸的地加瑞克、醇类溶剂和水的比例为0.26～0.30:4:1、0.26～0.30:5:1、0.26～0.30:6:1、0.26～0.30:7:1、0.26～0.30:8:1、0.26～0.30:9:1、0.26～0.30:10:1、0.26～0.30:12:1、0.26～0.30:15:1、0.26～0.30:20:1或0.26～0.30:25:1，优选约为0.26～0.30:5:1、0.26～0.30:6:1、0.26～0.30:7:1、0.26～0.30:8:1、0.26～0.30:9:1或0.26～0.30:10:1，更优选约为0.26～0.30:5:1或0.26～0.30:10:1，最优选约为0.26～0.30:5:1。
在一些实施方案中，其中以kg/l/l计，所述步骤(1)的含有三氟乙酸的地加瑞克、醇类溶剂和水的比例为为0.50:4:1、0.50:5:1、0.50:6:1、0.50:7:1、0.50:8:1、0.50:9:1、0.50:10:1、0.50:12:1、0.50:15:1、0.50:20:1或0.50:25:1，优选约为0.50:5:1、0.50:6:1、0.50:7:1、0.50:8:1、0.50:9:1或0.50:10:1，更优选约为0.50:5:1或0.50:10:1，最优选约为0.50:5:1。
在一些实施方案中，其中以mol/l计，所述步骤(1)的碱性酸式盐或弱碱与水的比例为0.10～4.00:1，优选为0.20～2.0:1，更优选为0.55～1.5:1，最优选为1.30～1.35:1或者0.73～0.83:1。在一些实施方案中，所述步骤(1)的反应的温度为20℃～37℃，优选地为25℃～35℃。
在一些实施方案中，所述步骤(1)的反应的时间为0.5h～8h，优选为1h～3h。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向步骤(1)的反应体系中加入有机溶剂的步骤；在一些实施方案中，所述向反应体系中加入有机溶剂的步骤是在反应进行一段时间后加入有机溶剂，所述时间可以为0.5h～8h，优选为1h～3h；在一些具体实施方案中，所述向反应体系中加入有机溶剂的步骤是在反应完毕后加入有机溶剂。
在一些实施方案中，所述有机溶剂为与水混溶的有机溶剂，所述与水混溶的有机溶剂选自丙酮、甲醇或乙醇的一种或一种以上.，优选为丙酮。
在一些实施方案中，所述有机溶剂与水的体积比为0.5～10:1，优选为1～5:1，最优选为2.5:1。
在一些实施方案中，所述步骤(1)通过如下步骤进行：
a)将含有三氟乙酸的地加瑞克与醇类溶剂和水的混合溶剂混合；
b)加入碱性酸式盐水溶液或弱碱水溶液进行反应。
在一些实施方案中，所述步骤a)的醇类溶剂和水体积比为2.5～30:0.25～0.5，优选为3～25:0.25～0.5，更优选为4～15:0.25～0.5，最优选为5～10:0.25～0.5。
在一些优选实施方案中，所述步骤a)的醇类溶剂和水体积比为2.5～30:0.25，优选为3～25:0.25，更优选为4～15:0.25，最优选为5～10:0.25。
在一些优选实施方案中，所述步骤a)的醇类溶剂和水体积比为2.5～30:0.5，优选为3～25:0.5，更优选为4～15:0.5，最优选为5～10:0.5。
在一些实施方案中，其中以kg/l计，所述步骤a)的含有三氟乙酸的地加瑞克和水的比例约为0.05～2.0:0.25～0.5，优选为0.1～1.0:0.25～0.5，更优选为0.2～0.5:0.25～0.5，最优选为0.26～0.3:0.25～0.5或者0.50:0.25～0.5。
在一些优选实施方案中，其中以kg/l计，所述步骤a)的含有三氟乙酸的地加瑞克和水的比例约为0.05～2.0:0.5，优选为0.1～1.0:0.5，更优选为0.2～0.5:0.5，最优选为0.5:0.5。
在一些优选实施方案中，其中以kg/l计，所述步骤a)的含有三氟乙酸的地加瑞克和水的比例约为0.05～2.0:0.25，优选为0.1～1.0:0.25，更优选为0.2～0.5:0.25，最优选为0.26～0.3:0.25。
在一些实施方案中，其中以kg/l/l计，所述步骤a)的含有三氟乙酸的地加瑞克、醇类溶剂和水的比例为0.05～2.0:2～30:0.25～0.5，优选为0.10～1.0:3～25:0.25～0.5，更优选为0.2～0.5:4～15:0.25～0.5，最优选为0.26～0.3:5～10:0.25～0.5或者0.5:5～10:0.25～0.5。
在一些优选实施方案中，其中以kg/l/l计，所述步骤a)的含有三氟乙酸的地加瑞克、醇类溶剂和水的比例为0.05～2.0:2～30:0.5，优选为0.10～1.0:3～25:0.5，更优选为0.2～0.5:4～15:0.5，最优选为0.5:5～10:0.5。
在一些具体实施方案中，其中以kg/l/l计，所述步骤a)的含有三氟乙酸的地加瑞克、醇类溶剂和水的比例为0.50:5:0.50或者0.50:10:0.50，优选为0.50:5:0.50。
在一些优选实施方案中，其中以kg/l/l计，所述步骤a)的含有三氟乙酸的地加瑞克、醇类溶剂和水的比例为0.05～2.00:2～30:0.25，优选为0.10～1.00:3～25:0.25，更优选为0.20～0.50:4～15:0.25，最优选为0.26～0.30:5～10:0.25。
在一些具体实施方案中，其中以kg/l/l计，所述步骤a)的含有三氟乙酸的地加瑞克、醇类溶剂和水的比例为0.26～0.30:5:0.25或者0.26～0.30:10:0.25，优选为0.26～0.30:5:0.25。
在一些实施方案中，所述步骤a)混合后得到的混合物为溶液。
在一些实施方案中，所述步骤a)混合的方式为振摇或者搅拌。
在一些实施方案中，所述步骤a)混合的时间为0.1h～2h，优选为0.5h。
在一些实施方案中，所述步骤b)中加入的碱性酸式盐水溶液或弱碱水溶液，其中以mol/l计，碱性酸式盐或弱碱与水的比例为0.10～4.00:0.5～0.75，优选为0.20～2.00:0.5～0.75，更优选为0.55～1.50:0.5～0.75，最优选为1.30～1.35:0.5～0.75或者0.73～0.83:0.5～0.75。
在一些优选实施方案中，所述步骤b)中加入的碱性酸式盐水溶液或弱碱水溶液，其中以mol/l计，碱性酸式盐或弱碱与水的比例为0.10～4.00:0.50，优选为0.20～2.00:0.50，更优选为0.55～1.50:0.50，最优选为1.30～1.35:0.50。
在一些优选实施方案中，所述步骤b)中加入的碱性酸式盐水溶液或弱碱水溶液，其中以mol/l计，碱性酸式盐或弱碱与水的比例为0.10～4.00:0.75，优选为0.20～2.00:0.75，更优选为0.55～1.50:0.75，最优选为0.73～0.83:0.75。
在一个更加具体实施方案中，所述步骤(1)于室温下，将地加瑞克粗肽加入到18l甲醇和1.8l纯化水中，搅拌溶解后，滴加包含约5.05mol碳酸钠溶液1.8l，搅拌反应0.5h。
在另一个更加具体实施方案中，所述步骤(1)于30℃～35℃，将地加瑞克粗肽加入到32.4l甲醇和1.62l纯化水中，搅拌溶解后，滴加包含约4.75mol碳酸氢钠溶液4.86l，搅拌反应0.5h。
在一些实施方案中，所述步骤(2)分离方式为过滤；任选地，所述过滤得到的固体用有机溶剂洗涤；在一些实施方案中，所述有机溶剂选自丙酮、醋酸、甲醇、乙醇、丙醇、乙醚、异丙醚、二氯甲烷的一种或一种以上，优选为丙酮、醋酸或异丙醚的一种或两种，最优选为丙酮。
任选地，所述步骤(2)进一步包括干燥的步骤，在一些具体实施方案中，所述干燥是在常温下减压干燥。
在一些实施方案中，所述步骤(2)进一步包括如下步骤：
c)将分离得到的固体与有机溶剂混合；
d)分离固体。
在一些实施方案中，所述步骤c)的混合方式为搅拌或者振摇，优选为搅拌(打浆)。
在一些实施方案中，所述步骤c)的有机溶剂选自丙酮、醋酸、甲醇、乙醇、丙醇、乙醚、异丙醚或二氯甲烷的一种或一种以上，优选为丙酮或醋酸的一种或两种，最优选为丙酮和醋酸的混合溶剂。
在一些实施方案中，所述步骤d)的固体进一步用有机溶剂洗涤；在一些实施方案中，所述有机溶剂选自丙酮、醋酸、甲醇、乙醇、丙醇、乙醚、异丙醚或二氯甲烷的一种或一种以上，优选为丙酮或醋酸的一种或两种，最优选为丙酮。
任选地，所述步骤d)进一步包括干燥的步骤，在一些具体实施方案中，所述干燥是在常温下减压干燥。
在一些实施方案中，所述步骤d)的固体进一步包括如下步骤：
i)将分离得到的固体与有机溶剂混合；
ii)分离固体。
在一些实施方案中，所述步骤i)的混合方式为搅拌或者振摇，优选为搅拌(打浆)。
在一些实施方案中，所述步骤i)的有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、乙醚、异丙醚或二氯甲烷的一种或一种以上，优选为丙酮或异丙醚的一种或两种，最优选为异丙醚。
任选地，所述步骤(ii)进一步包括干燥的步骤，在一些具体实施方案中，所述干燥是在常温下减压干燥。
在一些实施方案中，所述步骤(2)、步骤d)或者步骤ii)的固体进一步包括将固体通过液相色谱纯化的步骤。
在一些实施方案中，所述通过液相色谱纯化的步骤包括将所述固体以溶液的形式进行纯化，所述溶液的溶剂选自醋酸和甲醇一种或两种，优选为醋酸和甲醇的混合溶剂；在本申请的一些具体实施方案中，所述混合溶液中，以kg/l/l计，所述固体、醋酸和甲醇的比例为1：5：0.5。
在一些实施方案中，所述液相色谱为反相色谱，具体地，反相色谱使用c18反相色谱柱。
在一些实施方案中，所述液相色谱的流动相为流动相a和流动相b的组合，其中流动相a为醋酸和水的混合溶剂，流动相b为醋酸和乙腈的混合溶剂。
在一些实施方案中，所述流动相a中，醋酸和水的体积比为1.5：98.5。
在一些实施方案中，所述流动相b中，醋酸和乙腈的体积比为1.5：98.5。
在一些实施方案中，所述液相色谱的流动相的流速为5l/min。
在一些实施方案中，所述液相色谱纯化的步骤中，以l/kg计，所述流动相和所述固体的比例为205：36。
在一些实施方案中，所述液相色谱纯化的步骤的洗脱时间为300min。
在一些实施方案中，所述液相色谱纯化的步骤使用的流动相组成如下：当纯化时间在0到240min之间时，流动相组成为流动相a与流动相b，其体积比为95:5；当纯化时间在240-300min之间时，流动相组成为流动相a与流动相b，其体积比为77:23。
在一些实施方案中，所述液相色谱纯化的步骤包括将含有地加瑞克的洗脱液进行浓缩的步骤；在一些实施方案中，含有地加瑞克的洗脱液中地加瑞克的纯度不小于99％，优选地，含有地加瑞克的洗脱液中地加瑞克的纯度不小于99％且单个杂质含量不大于0.4％。
在一些实施方案中，所述液相色谱纯化的步骤包括将含有地加瑞克的洗脱液进行浓缩后再进行冻干的步骤。
术语“碱性酸式盐”是指由阳离子和多元酸的不完全电离酸根阴离子组成的盐，其水溶液显碱性。由于阴离子中含有在水中可电离的氢原子，因此被称作“酸式”盐，又因其水溶液显碱性，故称作“碱性酸式盐”。碱性酸式盐包括但不限于碱金属类的酸式盐以及碱土金属的酸式盐等，例如可以是碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硫氢化钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙等。
术语“弱碱”是指在水溶液中不完全电离的碱，例如可以是氨、甲胺、吡啶或三乙胺等。
术语“tfa”代表三氟乙酸。
本发明提供了一种工业化的碱性酸式盐或弱碱溶液去除固相合成地加瑞克粗肽中三氟乙酸的方法，该方法操作简便、成本低廉、绿色环保、耗时短且工艺稳定，适于工业上大规模去除地加瑞克中的三氟乙酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是示范性的，并不对本发明的范围构成任何限制，本申请使用的原料和试剂可以通过市售获得，也可以通过现有技术制备得到。
hplc检测三氟乙酸方法如下：
色谱柱：ymc-packods-aq柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相a：0.7％磷酸水溶液-甲醇(50:1)；流动相b：乙腈-水(50:50)；检测波长：210nm；流速：1.5ml/min；进样量：20μl。按下表进行梯度洗脱：
hplc检测地加瑞克纯度方法如下：
流动相：溶液a：0.3％三乙胺(用磷酸调节ph值为2.3)-乙腈(90:10)；溶液b：乙腈。
样品浓度：0.2mg/ml(2％醋酸溶液溶解)；色谱条件：agilentpeptidemap色谱柱(4.6mm×150mm；2.7μm)；检测波长：226nm；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；进样量：10μl；按下表进行梯度洗脱：
实施例1地加瑞克树脂肽的裂解沉淀
搅拌下，将1.37kg固相合成的地加瑞克树脂肽缓慢加入到6.85l预冷(0℃左右)的三氟乙酸中，加热至40℃，搅拌反应2.5小时，裂解结束。将裂解液抽至浓缩罐中，树脂用3×0.8l三氟乙酸洗涤树脂，合并洗涤液和裂解液，25～30℃减压浓缩至3.0l左右。搅拌下，将浓缩液缓慢加入到18l异丙醚(0℃以下预冷)中，并用0.5l三氟乙酸洗涤浓缩罐，滴加结束后抽滤，滤饼用3×3l异丙醚打浆，抽干得湿品，冷藏保存。
重复上述操作，进行第二小批裂解沉淀，合并两小批湿品，用6l异丙醚打浆，抽滤，30℃减压干燥12h，得1.8kg粗肽，纯度为96.33％，三氟乙酸含量为19.9％。
实施例2碳酸钠法去除三氟乙酸
na2co3水溶液的配置：将504gna2co3加入到1.8l纯化水中，35℃搅拌溶清后备用。
于25℃下，将按照实施例1制备得到的产物1.8kg加入到18l甲醇和1.8l纯化水的混合溶剂中，搅拌溶解后，滴加na2co3水溶液，10min滴加完毕。搅拌反应0.5h后加入9l丙酮，继续搅拌15min后抽滤，用9l丙酮淋洗。滤饼再用36l丙酮打浆1h后过滤，9l丙酮淋洗滤饼后抽干，25℃温度下减压干燥12h得1.08kg地加瑞克粗品，纯度为97.22％，三氟乙酸含量为1.70％。
实施例3碳酸氢钠法去除三氟乙酸
方案1
nahco3水溶液的配置：将424.4gnahco3加入到4.86l纯化水中，40℃搅拌溶解备用。
于30～35℃下，将按照实施例1制备得到的产物1.8kg加入到32.4l甲醇和1.62l纯化水的混合溶剂中，搅拌30min左右溶解后，滴加nahco3水溶液，15min左右滴加完毕。搅拌反应2h后加入16.2l丙酮，继续搅拌15min后抽滤，3.6l丙酮淋洗。滤饼再用16.2l丙酮和醋酸的溶液打浆30min，过滤，用3.6l丙酮淋洗抽干，再用18l异丙醚打浆，过滤后滤饼在30℃温度下减压干燥12h得1.2kg地加瑞克粗品，纯度为97.20％，三氟乙酸含量为1.43％。
方案2～5
参照方案1的方法，将按照实施例1制备得到的产物1.8kg分别加入到纯水、16.2l甲醇和1.62l纯化水的混合溶剂、64.8l甲醇和1.62l纯化水的混合溶剂、以及162l甲醇和1.62l纯化水的混合溶剂中，替换方案1中的“将按照实施例1制备得到的产物1.8kg加入到32.4l甲醇和1.62l纯化水的混合溶剂中”，分别得到方案2～5，结果见表1。
表1不同溶剂体系下去除三氟乙酸工艺比较
实施例4地加瑞克纯化液的制备
将实施例3方案1得到的地加瑞克粗肽1.08kg，平均分三批用dac-500分析型色谱仪(生产商：江苏汉邦科技有限公司)进行纯化，每小批上样量为360g，分别得到纯化液①、纯化液②、纯化液③。
以其中一批为例，投料量见表2
表2每一批地加瑞克粗品纯化的投料量
具体操作步骤如下所示：
将制备柱用流动相a:b＝95:5，以流速5l/min平衡4个柱体积(柱体积/60l)后，将粗肽按溶剂比例粗肽(kg)：醋酸(l)：甲醇(l)＝1：5：0.5溶解。检测波长：280nm，收集组分体积：3.0l/瓶，洗脱梯度如表3：
表3洗脱梯度
合并地加瑞克纯度(hplc面积归一化法)≥99.0％，单杂均≤0.4％的组分，得醋酸地加瑞克纯化液①。制备柱用流动相c冲洗3个柱体积后待用。
按照同样的方法，将其它两批进行纯化，分别得到纯化液②和纯化液③；合并纯化液①、纯化液②、纯化液③，35℃下减压浓缩至无明显液体流出，冻干后即得醋酸地加瑞克原料药，纯度为99.87％，未检出三氟乙酸。
对比实施例1用反相c18柱层析去除地加瑞克粗肽中三氟乙酸
按照实施例1得到的含三氟乙酸的地加瑞克粗肽1.8kg，平均分三批，用dac-500分析型色谱仪(生产商：江苏汉邦科技有限公司)除去三氟乙酸后，分别得到纯化液①、纯化液②、纯化液③。以其中一批为例，具体操作步骤如下所示：
将含三氟乙酸的地加瑞克粗肽600g加入2.5l醋酸溶解，用1μm滤膜过滤后备用；将制备柱用流动相①平衡4个柱体积(柱体积/60l)后，进行上样，然后除三氟乙酸，检测波长为280nm，流速为5l/min。
表4每一批含三氟乙酸的地加瑞克粗肽的投料量
用hplc检测洗涤液的三氟乙酸去除情况，完全除去后，以流动相②洗脱样品，收集所有含地加瑞克的洗脱液(约60l)，35～40℃下减压浓缩14h，得到约15l除去三氟乙酸后的地加瑞克粗肽纯化液①。按照同样的方法，将其它两批进行纯化，分别得到纯化液②和纯化液③；合并纯化液①、纯化液②、纯化液③。
c18柱层析法和碳酸钠法除地加瑞克粗肽中三氟乙酸步骤的工艺比较参见表5。
除去三氟乙酸后的地加瑞克粗肽进一步通过c18柱层析法纯化(例如采用实施例4的方法)得到醋酸地加瑞克原料药。
表5c18柱层析法和碳酸钠法除去三氟乙酸步骤的工艺比较