一种稳定表达猪源NOD2受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞及构建方法与流程

本发明属于生物技术领域。具体涉及稳定表达猪源nod2(pnod2)受体基因的nf-κb双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。更具体地说，本发明提供能够用于研究pnod2活化激活下游nf-κb启动子报告基因检测稳定细胞系。本发明也为rna-seq技术高通量筛选pnod2静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因提供了生物材料，并为进一步研究nod2的种属特异性奠定了基础和平台。

背景技术：

nod样受体(nlr)nlrc2(nod2)，nlr是位于细胞胞浆内的受体家族。人有22个成员，而鼠有34个成员。所有成员具有相似的结构域：n端的活性区域(effectordomain)，中间的核苷酸结合和聚合区(nucleotide-bindingandoligomerizationdomain,nod)和c端的lrr(leucinerichrepeats)基序。根据n端活性区的不同，分成五个亚类：nlra(acidactivationdomain),nlrb(baculovirusinhibitorofapoptosisrepeats),nlrc(caspaseactivationandrecruitmentdomain，card),nlrp(pyrin)和nlrx(unknowndomain)^[1]。nlrc2和nlrc1(也分别称为nod2和nod1)相类似，但与其它nlr不同：其它nlr活化后都没有基因转录而是形成炎症小体(inflammasome)，而nod2和nod1活化后激活转录因子nf-κb及相应基因转录。nod2和nod1识别细菌成分糖肽(分别为mdp和ie-dap)活化后，活性区域card与下游接头分子rip2同源区结合形成信号复合体，最终激活转录因子nf-κb和炎症因子表达^[1]。另外研究表明nod2能识别来自呼吸道合胞体病毒(rsv)、流感病毒(influenzavirus)和人巨细胞病毒(cmv)的rna并诱导抗病毒因子ifn^[1]。与rlr(rig-i和mda5)类似，nod2n端有2cards活性区，很可能在识别rna后形成2cards四聚体活化下游接头蛋白mavs从而诱导产生ifn。

有报道分离了猪的nod2并转染hek293细胞，nod2在转染细胞的胞浆和胞膜内侧表达，并发现nod2能介导mdp刺激激活下游nf-κb^[2]。之后有研究发现猪nod2的基因多态性与nod2的信号功能紧密相关^[3]。

家畜nlr信号研究内容匮乏，有必要建立研究猪nod2信号通路的细胞体系。

参考文献：

1.bryant,c.e.,etal.,internationalunionofbasicandclinicalpharmacology.xcvi.patternrecognitionreceptorsinhealthanddisease.pharmacolrev,2015.67(2):p.462-504.

2.tohnom1,uedaw,azumay,shimazut,katohs,wangjm,asoh,takadah,kawaiy,saitot,kitazawah.molecularcloningandfunctionalcharacterizationofporcinenucleotide-bindingoligomerizationdomain-2(nod2).molimmunol.2008jan；45(1):194-203.

3.jozakik1,shinkaih,tanaka-matsudam,morozumit,matsumotot,tokid,okumuran,eguchi-ogawat,kojima-shibatac,kadowakih,suzukie,waday,uenishih.influenceofpolymorphismsinporcinenod2onligandrecognition.molimmunol.2009dec；47(2-3):247-52。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种稳定表达猪源nod2受体(pnod2)基因的nf-κb双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。本发明建立在自主获得的pnod2基因和hek293-nf-κb双荧光素酶稳定报告细胞系的基础上，构建能够稳定表达猪源nod2受体基因的nf-κb双荧光素酶报告稳定细胞系。该细胞系既可以用于筛选验证pnod2与rna分子的识别和结合，也可以用于后续rna-seq技术研究nod2静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因分析研究。

本发明所采用的技术方案是：

一种稳定表达猪源nod2受体基因的nf-κb双荧光素酶报告细胞系，是指转入了猪源nod2的hek293-nf-κb细胞，所述hek293-nf-κb细胞是引入了nf-κb虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的hek293细胞。

本发明所述的稳定表达猪源nod2受体基因的nf-κb双荧光素酶报告细胞系的构建方法如下：

(1)含pnod2基因编码区的pcdna真核表达载体的构建

pnod2基因编码区的扩增和克隆。设计pcr引物，从猪pk15细胞rna中rt-pcr扩增pnod2基因编码区，扩增pcr片段经双酶切后和带有c-端ha表达标签的gatewaypentr4中间入门载体连接，经菌落pcr和酶切鉴定后获得阳性重组克隆。

lr位点特异重组反应。将鉴定的含pnod2的pentr4重组质粒(含attl位点)和目的pcdna表达载体pdest47(含attr位点)进行位点特异重组反应，经菌落pcr鉴定获得重组pcdnapnod2克隆。

重组pcdnapnod2的表达。重组pcdnapnod2转染293t细胞，48小时后细胞裂解物进行sds-page，蛋白转印膜进行抗ha抗体免疫印迹，结果表明pnod2在细胞中表达125kd的特异蛋白条带(图1)。

pnod2信号功能的鉴定。质粒pcdnapnod2转染293t细胞，24小时后用胞壁酰二肽(mdp)刺激12小时。提取所有细胞总rna，rt-pcr检测细胞下游细胞因子基因和相关基因表达(il-8和ifn-β)。结果表明pnod2转染组和和对照相比，pnod2表达自身就可以诱导il-8和ifn-β基因转录，同时可以介导mdp诱导il-8进一步表达(图2a)。nf-κb启动子试验也同样清楚表明pnod2不仅具有组成型活性，而且具备诱导性活性(图2b)。

(2)hek293-nf-κb双荧光素酶稳定报告细胞的构建：

培养人胚肾细胞(hek293)至融合度70％-80％，利用表达nf-κb虫荧光素(fluc)的慢病毒(blasticidin)感染hek293细胞，感染细胞用10μg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)筛选获得稳定表达nf-κb报告基因的hek293细胞系。经两次有限稀释法亚克隆，细胞克隆用tnf-α刺激细胞6-8小时，筛选对tnf-α刺激诱导产生高水平nf-κb活化，高表达fluc的单细胞克隆。上述细胞克隆用质粒tk海肾荧光素酶(rluc)和pbabehygro共转染，细胞经100μg/ml的潮霉素b(hygromycinb)筛选后获得稳定表达细胞。细胞再经过有限稀释法亚克隆，单个细胞克隆用不同浓度tnf-α刺激，选取对tnf-α刺激具有高水平fluc应答同时稳定高表达rluc的细胞克隆。

(3)pnod2-hek293-nf-κb稳定报告细胞系的构建：

培养hek293-nf-κb双荧光素酶报告细胞至融合度70％-80％，利用脂质体转染试剂lipofectin2000将含有pnod2基因的质粒pcdnapnod2转染入hek293-nf-κb细胞，经800μg/ml的g418筛选后获得表达pnod2编码基因的hek293-nf-κb细胞，经三轮细胞刺激鉴定筛选及扩大培养、获得稳定表达pnod2基因的hek293-nf-κb双荧光素酶稳定报告细胞系。

本发明公开了稳定表达猪源nod2(pnod2)受体基因的nf-κb荧光素酶稳定报告细胞系的制备方法。在获得hek293-nf-κb稳定表达双荧光素酶报告细胞系基础上，转染pnod2基因的真核表达质粒，经过g418筛选获得稳定表达猪源nod2(pnod2)受体基因的nf-κb双荧光素酶报告稳定细胞系。结果显示pnod2稳定报告细胞系能对对细菌mdp做出特异性应答(图3-4)。pnod2稳定报告细胞系的构建为进一步研究pnod2的功能奠定了生物材料基础，有利于进一步丰富有关pnod2的研究。双荧光素酶报告稳定细胞系含有内参荧光素报告基因，可以校正和避免实验中由于细胞毒性等差异造成的误差，使结果更为可信。

附图说明

图1：pnod2在转染细胞中的表达。

图2：pnod2信号功能的鉴定。

a，rt-pcr鉴定pnod2活化后引起下游细胞因子的转录。

b，nf-κb启动子双荧光素酶报告试验检测pnod2信号活性。

图3：nf-κb双荧光素酶报告实验验证pnod2-293-nf-κb稳定细胞系对多种刺激剂的应答。

图4：nf-κb双荧光素酶报告实验检验多次传代pnod2-293-nf-κb稳定细胞对mdp的特异应答。

具体实施方式

(1)含pnod2编码基因的pcdna真核表达载体的构建

pnod2基因编码区的扩增和克隆。

设计一对克隆pcr引物，上游引物为ttcgcggatccatgtgtgcccagggggctttccaggc(seqidno.1)；下游引物为ttcgcgatatcaagcaggagtctcgtgtccctctggctgagc(seqidno.2)。从猪pk15细胞提取总rna，反转录(rt)生成cdna,以cdna为模板，pcr扩增pnod2基因编码区，扩增得到大小为3.0kb的dna片段。扩增pcr片段经bamhi和ecorv双酶切后和带有c-端2xha表达标签的gatewaypentr4中间入门载体经t4连接酶连接，连接产物转化感受态top10，转化细菌top10涂布卡那霉素抗性(kanamycin)细菌琼脂平板，重组克隆经菌落pcr和酶切鉴定，阳性中间质粒进一步dna测序进行验证。

所述带有c-端2xha表达标签的gatewaypentr4中间入门载体的构建方法如下：

入门空载体pentr4-n-flag(优宝生物，www.youbio.cn产品编号：vt2038)质粒扩增后，用ncoi酶切，琼脂糖胶回收酶切大片段，t4连接酶连接，转化top10感受态细胞，涂布卡那霉素(kanamycin)琼脂培养板。从转化菌落中提取质粒，dna测序确定得到去除n-端flag标签的质粒pentr4。

合成序列atcaccagctacccatacgatgttcctgactatgcgggctatccctatgacgtcccggactatgcatag(seqidno.3)及其互补序列，变性退火形成双链平端dna(dsdna)。质粒pentr4用ecorv酶切，碱性磷酸酶(ap)去磷酸化处理，和上述平端dna用t4连接酶连接，连接产物转化top10感受态细胞，涂布卡那霉素琼脂培养板。从转化菌落中提取质粒，ecorv酶切并dna测序鉴定。所合成的dna序列为2xha标签编码序列，5端加atcaccagc，3端加终止密码子tag。正确连接的ha标签序列上游保留了ecorv，下游是合成的终止密码子tag。

lr位点特异重组反应。

将经鉴定并序列正确的重组中间质粒pentr4-pnod2-2xha(含attl位点)和目的pcdna表达载体pdest47(含attr位；addgene,货号#36139)在lrclonsae(thermofisher,货号12538120)作用下进行位点特异lr重组反应，反应产物转化感受态dh5α并涂布氨苄青霉素(ampicillin)琼脂培养板，菌落pcr鉴定转化菌落，从阳性菌落培养物中提取质粒，获得重组目的表达质粒pcdnapnod2。

重组pcdnapnod2的表达。

分0.3x10⁶细胞/孔于24-孔培养板，第二天用脂质体转染试剂lipofectamine2000(thermofisher)转染1μg重组pcdnapnod2到24-孔培养板中293t细胞。48小时后细胞裂解物进行sds-page，蛋白转印膜进行抗ha抗体免疫印迹，结果表明pnod2在细胞中表达125kd的特异蛋白条带(图1)。

pnod2信号功能的鉴定。

rt-pcr功能鉴定：质粒pcdnapnod2用lipofectamine2000转染293t细胞，24小时后用细菌胞壁酰二肽mdp(invivogen,货号：tlrl-mdp)1μg/ml刺激12小时。提取所有细胞总rna，rt-pcr检测细胞下游细胞因子基因il-8和ifnβ的表达。结果表明pnod2转染组和和对照相比，pnod2表达自身就可以诱导il-8和ifnβ转录尤其是ifnβ转录，同时可以介导mdp诱导il-8进一步表达(图2a)。nf-κb启动子报告基因鉴定：pcdnapnod2和nf-κbelam启动子驱动的虫荧光素酶报告基因(fluc)以及海肾荧光素酶报告基因(rluc)共转染293t细胞，转染24小时后，细胞用于mdp刺激12小时。收获细胞并裂解细胞，细胞裂解液用transdetectdouble-luciferasereporterassaykit(transgenbiotech)检测nf-κb报告基因表达活性。试验结果也同样清楚表明pnod2不仅具有组成型活性，而且具备mdp诱导性活性(图2b)。

(2)hek293-nf-κb双荧光素酶稳定报告细胞的构建：

培养人胚肾细胞(hek293)至融合度70％-80％，利用表达nf-κb虫荧光素(fluc)的慢病毒(blasticidin)感染hek293细胞，感染细胞用10μg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)筛选获得稳定表达nf-κb报告基因的hek293细胞系。两次有限稀释法亚克隆，细胞克隆用tnf-α刺激细胞6-8小时，筛选对tnf-α刺激诱导产生高水平nf-κb活化，高表达fluc的单细胞克隆。上述细胞克隆用质粒tk海肾荧光素酶(rluc)和pbabehygro共转染，细胞经100μg/ml的潮霉素b(hygromycinb)筛选后获得稳定表达细胞。细胞再经过有限稀释法亚克隆单个细胞克隆用不同浓度tnf-α刺激，选取对tnf-α刺激具有高水平fluc应答同时稳定高表达rluc的细胞克隆。

(3)pnod2-hek293-nf-κb稳定表达细胞系的构建：

培养hek293-nf-κb双荧光素酶报告细胞至融合度70％-80％，利用脂质体转染试剂lipofectin2000将含有pnod2基因的质粒pcdnapnod2转染入hek293-nf-κb报告细胞，经800μg/ml的g418筛选1-2周后获得表达pnod2编码基因的hek293-nf-κb细胞，经三轮细胞刺激鉴定筛选及扩大培养、获得稳定表达pnod2基因的hek293-nf-κb双荧光素酶稳定报告细胞系。

(4)pnod2-hek293-nf-κb稳定表达细胞的刺激试验：

分0.3x10⁵pnod2-hek293-nf-κb细胞/孔于96-孔培养板过夜培养，第二天用7种刺激剂包括mdp(1μg/ml)(invivogen,货号：tlrl-mdp),ie-dap(10μg/ml)(invivogen,货号：tlrl-dap),lps(1μg/ml)(invivogen,货号：tlrl-b5lps),cpg2007(10μg/ml)(人工合成寡核苷酸，序列为seqidno.4：tccatgacgttcctgacgtt),fsl-1(10μg/ml)(invivogen,货号：tlrl-fsl),lwmpic(1μg/ml)(invivogen,货号：tlrl-picw)和hmwpic(1μg/ml)(invivogen,货号：tlrl-pic)刺激pnod2-hek293-nf-κb稳定表达细胞，刺激12小时后，双重荧光素酶报告试验检测下游报告基因的活性(transdetectdouble-luciferasereporterassaykit,transbiotech,货号，fr201-02)。具体如下：弃营养液，每孔加50μl细胞裂解液裂解10分钟左右，取20μl于96孔分析板中，先加入15μlluciferasereactionreagenti轻轻混匀放入化学发光仪中读出萤火虫荧光素酶报告基因(fluc)的活性，再加入15μlluciferasereactionreagentⅱ混匀后读出海肾荧光素酶报告基因(rluc)的活性，fluc经rluc校正后，各刺激样品的fluc/rluc数值和不刺激(ns)对照数值比对，计算各刺激样品刺激倍数(图3)。

将pnod2-hek293-nf-κb稳定表达细胞多次传代后，分0.3x10⁵细胞/孔于96-孔培养板过夜培养，第二天用特异性刺激剂mdp(1μg/ml)刺激稳定细胞。刺激12小时后双重荧光素酶报告试验检测下游报告基因的活性(transdetectdouble-luciferasereporterassaykit,transbiotech,货号，fr201-02)。弃营养液，每孔加50μl细胞裂解液裂解10分钟左右，取20μl于96孔分析板中，先加入15μlluciferasereactionreagenti轻轻混匀放入化学发光仪中读出fluc的活性，再加入15μlluciferasereactionreagentⅱ混匀后读出rluc的活性，fluc经rluc校正后，刺激样品的fluc/rluc数值和不刺激(ns)对照数值比对，计算刺激样品刺激倍数(图4)。

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<110>扬州大学

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