利用植物棉子糖合成通路提高种子活力及耐贮性的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及利用调控植物棉子糖合成通路提高种子活力及耐贮性的应用，具体地说，涉及通过双过表达gols与rs基因提高种子活力及耐贮性的研究。

背景技术：

棉子糖系列寡糖(raffinosefamilyoligosaccharides，rfos)是植物中特有的一类半乳糖苷系列寡糖，国内外研究表明其在抵抗非生物逆境胁迫、种子脱水耐性及其活力形成过程中可能发挥重要功能。rfos合成通路第一步限速酶肌醇半乳糖苷酶(galactinolsynthase，gols)与种子活力形成密切相关。在拟南芥中过表达鹰嘴豆cagols基因能够提高种子耐贮性。关于rfos第二步关键酶棉子糖合成酶(raffinosesynthase，rs)调控种子活力目前未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供利用调控植物棉子糖合成通路提高种子活力及耐贮性的应用，通过pcr方法克隆了玉米grmzm2g150906基因(命名为zmrs)。将该基因与玉米肌醇半乳糖苷合成酶基因zmgols2(grmzm5g872256)在拟南芥中进行共表达，提高了拟南芥种子中rfos的总含量，增强了种子活力及耐贮性，且其表现远优于单表达zmgols2株系。本发明主要内容为：在植物中共表达棉子糖合成通路基因gols2(肌醇半乳糖苷合成酶)与rs(棉子糖合成酶)基因，提高种子活力及其耐贮性(延长其贮藏寿命)。

其具体技术方案为：

通过在植物中同时过表达galactinolsynthase(gols)、raffinosesynthase(rs)基因在提高植物种子活力过程中的应用。

通过在植物中表达galactinolsynthase(gols)、raffinosesynthase(rs)基因在调控种子中棉子糖系列寡糖含量及分配过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明克隆了玉米棉子糖合成关键酶基因zmgols2(肌醇半乳糖苷合成酶/grmzm5g872256)、zmrs(棉子糖合成酶/grmzm2g150906)，通过构建真核表达载体，利用农杆菌转化法分别获得zmgols2、zmrs单过表达及zmgols2/zmrs双过表达转化株系，调控了拟南芥种子中棉子糖系列寡糖(rfos)的含量及分配，增强了种子活力及其耐贮性。zmgols2单过表达可使拟南芥种子耐贮性提高43％。zmgols2/zmrs双过表达较zmgols2单过表达相比效果更为优异，可使拟南芥种子耐贮性提高102％。

附图说明

图1pcsgfpbt载体示意图。

图2pbi111l载体示意图。

图3zmgols2、zmrs单表达及zmgols2/zmrs双表达拟南芥的分子及种子寡糖组分鉴定。(a)拟南芥转化载体构建示意图。(b)转基因拟南芥分子鉴定。上半部分为rt-pcr检测，鉴定转基因植株目标基因的mrna表达水平；下半部分为westernblot检测，鉴定转基因植株中zmrs蛋白表达水平。(c-h)各转基因拟南芥株系种子可溶性糖组分鉴定。(c)蔗糖；(d)肌醇；(e)肌醇半乳糖；(f)棉子糖；(g)水苏糖；(h)毛蕊花糖。图中不同字母表示不同株系之间存在显著差异(duncantest)。

图4zmgols2、zmrs单表达及zmgols2/zmrs双表达拟南芥的种子活力鉴定。收获后经脱水的拟南芥种子在饱和kcl(rh83％)，42℃条件下人工老化3天，经室温晾晒1天后进行种子活力及耐贮性评测。(a)经人工老化处理或未经处理的拟南芥各株系种子ttc染色情况，着色(红色)越深代表种子活力越高。(b)经人工老化处理或未经处理的拟南芥各株系种子吸胀萌发后120小时表型图。(c)经人工老化处理或未经处理的拟南芥各株系种子萌发(％)速率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1、通过pcr方法克隆了玉米zmrs基因的编码区，构建了该基因植物表达载体。

对水培的三叶期玉米幼苗进行脱水处理。从脱水处理2小时的叶片提取rna并将其反转录成cdna。

以cdna为模板，用上游引物5’-cgcggatcctggctcccaacctcagcaagaag-3’和下游引物5’-tgctctagaggtagacgtactggacgcgacacag-3’对zmrs的编码区进行pcr扩增。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min20s，35个循环；72℃终延伸10min。将扩增产物切胶回收，用bamhi和xbai酶切片段，后与pcsgfpbt载体(用于拟南芥稳定转化，见下图1)连接。将pcsgfpbt上ncoi与bamhi酶切位点之间的gfp表达框替换为一段短序列，然后将扩增并酶切的zmrsorf片段连在bamhi和xbai位点之间，构建超表达拟南芥载体。载体有植物转化筛选标记潮霉素基因(见图2a)。载体上的zmrsorf片段经测序正确后转入农杆菌gv3101，用花序侵染法侵染拟南芥col0野生型。

构建另一个用于构建zmgols2/zmrs双表达株系的zmrs表达载体。以上游引物5’-cgcggatccatggctcccaacctcagcaagaag-3’及下游引物5’-ctagactagttcagtagacgtactggacgcgacac-3’扩增zmrs编码区。扩增程序同上。将zmrsorf区连接于pbi111l载体上的bamhⅰ-speⅰ酶切位点之间。经测序正确后转入gv3101农杆菌，通过浸花法在过表达zmgols2遗传背景的株系上进行侵染。

t0代种子经过70％乙醇室温1min，20％次氯酸钠室温5min消毒后，均匀涂布在ms平板上(含潮霉素或卡那霉素25mg/l)。4℃处理3天后转移至22℃培养箱生长。萌发约7-10天，转基因植株的叶深绿，根较长；非转化的植株叶浅绿，根短，不能长期存活。将转化体移入营养土中生长直到收t1代种子。t1代种子按上述方法筛选，收t2代种子(每个株系收多个单株)。每个t2代单株种子分别筛选，种植，收集每个单株的t3代种子，筛选每个单株的t3代种子，后代不分离的(均对潮霉素有抗性)进行下一步鉴定。

2、转基因株系的分子鉴定

通过rt-pcr对转化植株进行mrna表达水平鉴定。通过westernblot对转化植株进行zmrs蛋白表达水平鉴定。

rt-pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；72℃终延伸8min。

westernblot步骤参照报道[4]。zmrs一抗为课题组免疫家兔制备，使用稀释倍数为1：5000；二抗(羊抗兔)购于康为公司，使用稀释倍数为1：10000。

3、转基因株系种子中的游离糖组分鉴定。

对各拟南芥株系种子糖组份测定方法如下：使用收获并经脱水的成熟种子0.2g，液氮研磨至粉末后加入5ml80％乙醇(含200μg/ml乳糖)，继续研磨至匀浆。将匀浆倒入10ml离心管中，再往研钵中加入2ml80％乙醇(含200μg/ml乳糖)，清洗研钵，合并在离心管中。将样品置于80℃水浴锅中加热30min。室温，12000×g离心20min。将上清转移至另一干净的离心管中。95℃加热，将乙醇蒸发。将样品在-80℃冰箱中冻存24小时。真空抽干。hplc级双蒸水将样品重悬。12000×g离心20min。上清冻存于-20℃冰箱中。测定前用0.22μm过滤。hplc检测器为waters2424elsd，色谱柱为watersxbrige氨基柱。上样量为5μl。双过表达zmgols2/zmrs基因能够提高种子中rfos总量(图3)。

4、转基因株系种子活力及其耐贮性鉴定。

使用人工老化方法对拟南芥各株系进行种子活力鉴定。使用2ml收纳各株系成熟种子0.05g，放入干燥器中。干燥器中相对空气湿度由饱和kcl控制(83％rh)。将密封好的干燥器放入42℃培养箱中，对种子老化3天。老化结束后将各株系种子从干燥器中拿出，室温晾晒一天。进行ttc染色及萌发实验。

ttc染色对种子活力进行鉴定。经老化或未经老化的各株系拟南芥种子经消毒液(10％次氯酸，0.03％tween-20)浸泡5min后，以双蒸水洗涤种子5次。加入1ml1％ttc溶液(50mm磷酸缓冲液，ph-7.0)，黑暗条件下水浴(25℃)染色48小时。着色后的种子以双蒸水洗涤5次，经脱色液(水：苯酚：乳酸：甘油＝1：1：1：2，v/v)脱色4小时后在体式显微镜下拍照记录。红色着色越深代表种子活力越高。

对经老化或未经老化的各株系拟南芥种子进行萌发实验。将种子1/2ms培养板上进行萌发，每12小时对萌发率进行统计(体式显微镜观察)，统计至156小时。种子抗老化能力以老化种子吸胀后84小时的萌发比例(以野生型拟南芥为100％)表示。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>利用植物棉子糖合成通路提高种子活力及耐贮性的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>1038

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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