抗病毒活性物质Tenecin活性肽的研制实验方法与流程

本发明涉及农业
技术领域：
，尤其涉及一种抗病毒活性物质tenecin活性肽的研制实验方法。
背景技术：
：植物病毒病是农业生产的严重威胁，每年造成严重的经济损失。有效的防治植物病毒病一直是世界范围内的难题。长期以来，化学农药一直是防治植物病毒的首选方法。然而由于化学病毒制剂的长期、大量使用，造成严重的“农药公害”，因此，从生物源寻找与开发新型的高活性抗病毒药物，不仅具有很高的理论价值，而且在控制作物病毒病绿色生态农业持续发展中具有重要的实践意义。技术实现要素：本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种抗病毒活性物质tenecin活性肽的研制实验方法。本发明通过以下技术方案来实现上述目的：本发明包括实验材料：选择50～60日龄黄粉虫幼虫，放置在长29cm宽21.5cm高7cm塑料盆中，一周投喂一次精料，一天投喂一次青料，在温度26℃、湿度60％恒定环境中饲养；引物：根据genbank公布的黄粉虫tenecin基因序列设计特异引物，上游引物为：5'-ggggtaccatgcacgagatcacgatg-3'，下游引物：5'-cgggatccctagaccctctttccgtt-3'，并引入kpni和bamhⅰ酶切位点，扩增片段长度为252bp；黄粉虫rna的提取及rt-pcr：采用苯酚－氯仿法提取黄粉虫总rna，用superrtcdna第一链合成试剂盒以提取的黄粉虫总rna为模板进行体外反转录扩增，以合成的cdna为模板进行pcr反应；pcr在25μl体系中进行，2μlcdna模板，2.5μl25mmmg2+，2.5μldntp，2.5μl10×聚合酶缓冲液，0.5μl5u/μltaq聚合酶，2μl上下游引物；反应程序如下:94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72延伸10min.pcr产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，观察特异性条带的出现，以判断克隆的重组结果；tenecin基因原核表达载体的构建：将rt-pcr产物回收，连接于pet28a(+)载体，转化e.colidh-5a中，随机挑取克隆进行质粒提取，pcr及kpni和bamhⅰ双酶切鉴定阳性克隆，pcr反应体系及反应条件同1.3所述；酶切体系20μl按说明书进行；阳性克隆进行测序再次验证；重组质粒pet28a(+)-tenecin的转化及诱导表达：将阳性重组载体pet30a(+)-tenecin转化到原核表达菌株pbl121中；重组菌体均匀涂布到lb固体培养基上，37℃培养10h；挑取单克隆于lb液体培养基，250r/min、37℃过夜培养，按照1∶100的比例进行扩大培养至d600＝0.5～0.6，加入终浓度为1mmol/l的iptg进行诱导，250r/min、37℃培养约4h，12000r/min、30s离心收集菌体，进行12.5％的sds-page电泳，并用考马斯亮蓝染液进行染色鉴定靶蛋白是否成功表达；表达产物的纯化：将阳性菌株按1％的接种量接种于200ml的lb培养基，含终浓度为50μg/ml的kan中的大量诱导表达靶蛋白，37℃气浴振荡培养至od600＝0.6～0.8后，取出1ml未诱导的菌液做为对照，然后加入终浓度为1mmol/liptg诱导表达4h；然后用50ml离心管分装菌液，置于高速冷冻离心机下4℃4000rpm离心10min，收集菌体，用20ml预冷的1×bindingbuffer(0.5mol/lnacl,20mmol/ltris-hcl,5mmol/limidazole,ph7.9)重悬菌体；在冰上超声破碎菌体，收集上清；上清液采用aktapurify10系统纯化回收；15％sds-page和westernblotting检测蛋白质纯化效果；表达蛋白抗病毒活性的检测：以5～6叶期的tmv枯斑寄主心叶烟为实验对象，用ddh2o将纯化得到靶蛋白溶液稀释到终浓度为10μg/ml，然后与等体积的tmv病毒液混合，静置0.5h；同体积的ddh2o与tmv病毒液混合实验对照；采用半叶枯斑法检测靶蛋白抗病毒活性。本发明的有益效果在于：本发明是一种抗病毒活性物质tenecin活性肽的研制实验方法，与现有技术相比，本发明借助tmv的枯斑寄主心叶烟研究了植物源抗病毒活性物质tenecin活性肽对tmv的抗病毒活性。目前实验结果表明tenecin具有体外钝化病毒、抑制病毒侵染的活性，为tenecin活性肽的研发和推广应用提供了理论基础。附图说明图1是本发明的iptg诱导tenecin活性肽体外表达图；图2是本发明的tenecin活性肽westernblot验证图；图3是本发明的tenecin对tmv体外钝化作用对照图；图4是本发明的半叶枯斑法分析tenecin活性肽对tmv的抑制活性对照图。图1中：m：蛋白marker；1：未经iptg诱导菌株；2：iptg诱导后上清夜部分；3：iptg诱导后沉淀部分。图2中：1：iptg诱导后上沉淀部分；2：iptg诱导后上清液部分。图4中：图a：处理1，先摩擦接毒tmv，24h后涂抹tenecin活性肽，每半片叶片涂药50μl；图b：处理2，先涂抹tenecin活性肽，24h后摩擦接毒tmv，每半片叶片涂药50μl；图c：处理3，先摩擦接毒tmv，24h后涂抹宁南霉素，每半片叶片涂药50μl；图d：处理4，先涂抹宁南霉素，24h后摩擦接毒tmv，每半片叶片涂药50μl。具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步说明：本发明包括实验材料：选择50～60日龄黄粉虫幼虫，放置在长29cm宽21.5cm高7cm塑料盆中，一周投喂一次精料，一天投喂一次青料，在温度26℃、湿度60％恒定环境中饲养；引物：根据genbank公布的黄粉虫tenecin基因序列设计特异引物，上游引物为：5'-ggggtaccatgcacgagatcacgatg-3'，下游引物：5'-cgggatccctagaccctctttccgtt-3'，并引入kpni和bamhⅰ酶切位点，扩增片段长度为252bp；黄粉虫rna的提取及rt-pcr：采用苯酚－氯仿法提取黄粉虫总rna，用superrtcdna第一链合成试剂盒以提取的黄粉虫总rna为模板进行体外反转录扩增，以合成的cdna为模板进行pcr反应；pcr在25μl体系中进行，2μlcdna模板，2.5μl25mmmg2+，2.5μldntp，2.5μl10×聚合酶缓冲液，0.5μl5u/μltaq聚合酶，2μl上下游引物；反应程序如下:94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72延伸10min.pcr产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，观察特异性条带的出现，以判断克隆的重组结果；tenecin基因原核表达载体的构建：将rt-pcr产物回收，连接于pet28a(+)载体，转化e.colidh-5a中，随机挑取克隆进行质粒提取，pcr及kpni和bamhⅰ双酶切鉴定阳性克隆，pcr反应体系及反应条件同1.3所述；酶切体系20μl按说明书进行；阳性克隆进行测序再次验证；重组质粒pet28a(+)-tenecin的转化及诱导表达：将阳性重组载体pet30a(+)-tenecin转化到原核表达菌株pbl121中；重组菌体均匀涂布到lb固体培养基上，37℃培养10h；挑取单克隆于lb液体培养基，250r/min、37℃过夜培养，按照1∶100的比例进行扩大培养至d600＝0.5～0.6，加入终浓度为1mmol/l的iptg进行诱导，250r/min、37℃培养约4h，12000r/min、30s离心收集菌体，进行12.5％的sds-page电泳，并用考马斯亮蓝染液进行染色鉴定靶蛋白是否成功表达；表达产物的纯化：将阳性菌株按1％的接种量接种于200ml的lb培养基，含终浓度为50μg/ml的kan中的大量诱导表达靶蛋白，37℃气浴振荡培养至od600＝0.6～0.8后，取出1ml未诱导的菌液做为对照，然后加入终浓度为1mmol/liptg诱导表达4h；然后用50ml离心管分装菌液，置于高速冷冻离心机下4℃4000rpm离心10min，收集菌体，用20ml预冷的1×bindingbuffer(0.5mol/lnacl,20mmol/ltris-hcl,5mmol/limidazole,ph7.9)重悬菌体；在冰上超声破碎菌体，收集上清；上清液采用aktapurify10系统纯化回收；15％sds-page和westernblotting检测蛋白质纯化效果；表达蛋白抗病毒活性的检测：以5～6叶期的tmv枯斑寄主心叶烟为实验对象，用ddh2o将纯化得到靶蛋白溶液稀释到终浓度为10μg/ml，然后与等体积的tmv病毒液混合，静置0.5h；同体积的ddh2o与tmv病毒液混合实验对照；采用半叶枯斑法检测靶蛋白抗病毒活性。实验结果：tenecin体外诱导表达iptg诱导后，大部分特异性条带存在于上清液中,该蛋白质的分子量约为11kda，其分子量与理论值(11.25kdaku)相符，推测该蛋白质很可能是诱导表达的融合蛋白his-tenecin(如图1所示)。tenecin融合蛋白的分离纯化将收集得到纯度较高的目的蛋白溶液，经aktapurify10纯化回收系统纯化回收目的蛋白，纯化后融合蛋白分别用抗his标签鼠单克隆抗体和山羊抗小鼠igg单抗进行杂交显色后,在11.25kda处有条带出现(图2),确为所要的蛋白。tenecin抗病毒活性验证tenecin对tmv的钝化作用将tenecin活性肽处理的tmv粗提液采用人工摩擦接毒方法接种到枯斑寄主心叶烟(nicotiamaglutinosa)上，接种3-5天后统计了每株烟草接种叶片的枯斑数目，计算枯斑抑制率。实验结果表明tenecin活性肽处理的tmv接种心叶烟(nicotiamaglutinosa)时，处理组的半片叶片的枯斑数目明显要少于对照的半片叶片(图3，将tenecin活性肽处理的tmv粗提液采用人工摩擦接毒方法接种到枯斑寄主心叶烟(nicotiamaglutinosa)上，接种3～5天后统计了烟草接种叶片的枯斑数目，对照是未经tenecin活性肽处理的tmv粗提液直接摩擦接毒)。按照公式计算表明tenecin活性肽对tmv的枯斑抑制率为71.13％，表明tenecin活性肽对烟草普通花叶病毒具有较强的体外钝化作用(表1)。表1：tenecin活性肽对tmv的钝化作用重复1a重复2重复3平均处理叶71110-对照叶263239-枯斑抑制率(％)b73.0865.6374.3671.13注：a表示tenecin活性肽对tmv体外钝化实验共设3个重复，每个重复10株心叶烟(nicotiamaglutinosa)。接种3～5天后统计处理叶和对照叶片的枯斑数目。b表示根据统计的枯斑数目计算tenecin活性肽枯斑抑制率。tenecin对tmv的抑制作用在心叶烟(nicotiamaglutinosa)上，采用半叶枯斑法分析tenecin活性肽对tmv在枯斑寄主上的抑制作用，实验共设置5个处理，3-5天后统计心叶烟(nicotiamaglutinosa)上各个处理叶片的枯斑数目。实验结果显示，在涂抹药剂的心叶烟(nicotiamaglutinosa)上，处理叶片的枯斑数目明显小于对照心叶烟(nicotiamaglutinosa)上接种叶片的枯斑数目，但是同一药剂不同处理的烟草接种叶片的枯斑数目有差异，同一处理不同药剂也有差异(表2；图4)。对同一药剂而言，处理1与处理2相比，处理1的心叶烟(nicotiamaglutinosa)涂药的半片叶片上的枯斑数目要比处理2的枯斑数目稍多，并且产生枯斑的时间较处理2短，枯斑抑制率也小于处理2。同样，处理3与处理4相比，处理3的枯斑数目比处理4的枯斑数目稍多，且产生枯斑的时间短，枯斑抑制率也小于处理4。处理1与处理3相比，处理1的枯斑数目稍多，枯斑抑制率稍低于处理3。相反，处理2与处理4相比，处理4的枯斑数目要比处理3稍多，枯斑抑制率要低于处理3(表2)。表2：tenecin活性肽对tmv的抑制作用注：a完成接种3-5天统计每片接种叶片的枯斑数目；b实验共设4个处理，处理5为对照组，每个处理3个重复，每个重复15株烟草，每株烟草接种2个叶片。tenecin活性肽在体外对tmv有钝化作用。在本实验中通过将tenecin活性肽与tmv粗体液混合，人工摩擦接毒到tmv的枯斑寄主心叶烟(nicotiamaglutinosa)来检验tenecin活性肽在体外对tmv的钝化作用。实验结果显示，处理组烟草的枯斑数目明显少于对照组。该结果表明tenecin活性肽在体外对tmv有一定的钝化作用，能减弱tmv侵染烟草的能力。但是，tenecin活性肽对tmv的钝化作用是有限。接种3～5天后，在处理组的烟草叶片也出现了枯斑。一方面可能是tenecin活性肽对tmv的钝化作用是暂时的、有限的。tenecin活性肽长期暴露在空气中，本身的活性可能会有所下降，随着时间的推移，对tmv的钝化作用逐渐减弱，使得tmv逐渐恢复活性。另一方面可能由于tmv非常稳定。研究表明tmv是最稳定的病毒之一，有着很广的生存环境，广泛存在于活体寄主、植物残体、大田土壤，在低温和高温条件仍旧能保持一定的活性。因此即使在tenecin活性肽强烈钝化下，tmv仍旧保持很强的侵染活性。不同处理方式对tenecin活性肽抗病毒活性有影响。在tmv的枯斑寄主上，实验设计了5个处理对tenecin活性肽抗病毒活性进行系统的研究。实验结果表明，采用处理2的施药方式，tenecin活性肽对tmv有更好的抑制作用。在处理2中，tenecin活性肽首先被涂抹到烟草叶片上。这种施药方式能更好抑制tmv的原因可能有如下：一是tenecin活性肽首选在烟草叶片表面形成一层保护膜，当tmv入侵时，这层保护膜发挥了钝化病毒的作用，阻止了部分病毒侵染烟草；二是tenecin可以诱导植物产生抗病性。当tenecin活性肽首先被涂抹到烟草叶片上时，烟草体内的防御体系被激活，自身抵抗病原物的能力被迅速提高，能有效抵御tmv的侵染。tmv作为常见的植物病毒之一，每年都会给烟草、黄瓜、马铃薯等重要的经济作物造成严重的经济损失。tmv等植物病毒的防治一直是世界范围的难题。目前实验结果表明本实验筛选的植物源抗病毒活性tenecin活性肽具有体外钝化病毒、抑制病毒侵染的活性，这为tmv等植物病毒有效防治提供物质基础，拓宽了植物病毒生物防治的途径，具有重要的应用价值。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12