虾肝肠胞虫（EHP）的RAA恒温荧光检测方法及试剂与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾肝肠胞虫的raa恒温荧光检测方法及试剂盒。
背景技术：
：虾肝肠胞虫(enterocytozoonhepatopenaei，ehp)又称肠胞虫，是近年来发现与对虾中的微孢子虫，主要感染染凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)、斑节对虾(penaeusmonodon)等重要养殖虾类，2009年于泰国养殖池塘生长迟缓的斑节对虾中发现。有报道ehp在泰国和越南出现白便综合征(whitefaecessyndrome，wfs)的斑节对虾和凡纳滨对虾中有较高的检出率，且严重感染虾肝肠胞虫。感染肠胞虫的虾可以发现生长缓慢，严重影响了对虾的养殖生产周期。而对虾中的微孢子虫一旦混入水产食品，将会影响人体的健康。迄今仍然没有能有效控制肠胞虫疫情的技术措施，国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的ehp病原检测方法是减少虾肝肠胞虫发生和危害的重要途径。泰国学者(amornratetal，2013；suebsingetal，2013；tourtipetal，2009)已经报道了pcr法、地高辛标记核酸探针原位杂交法以及lamp检测方法检测寄生于斑节对虾和凡纳滨对虾肝胰腺中的ehp。目前检测方法正向更特异、更快速、更便捷、更安全、集成化、微量化、定量化、费用低廉化的方向发展，但这种方法耗时、特异性和灵敏度低，远不能满足日常快速检测工作的需要。自问世以来，pcr技术凭借灵敏、特异、快速等优点，被普遍应用于水产养殖病原的检测中。但pcr技术对实验环境和操作要求苛刻，产物容易污染，导致假阳性。与一般pcr技术相比，荧光pcr检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光pcr耗时长，成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。lamp等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用还是比较局限。本发明建立了raa恒温荧光来检测虾肝肠胞虫的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。重组酶介导扩增(recombinase-aidamplification，raa)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与rpa不同的是，raa扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全互补的序列时，在单链dna结合蛋白(single-strandeddnabinding，ssb)的帮助下，使模板dna解链，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在raa反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个raa扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的是提供对虾肝肠胞虫(ehp)的raa恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：一种对虾肝肠胞虫(ehp)核酸的检测试剂盒，包括：对虾肝肠胞虫正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾肝肠胞虫正向引物核苷酸序列如seqidno.1所示、所述对虾肝肠胞虫反向引物核苷酸序列如seqidno.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如seqidno.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texasred或lcred460中的一种，荧光淬灭基因选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一种。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、abuffer、bbuffer、raa干粉试剂、对虾肝肠胞虫标准品和ddh2o中至少一种。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述abuffer为20％peg；bbuffer为280mmmgac。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的raa干粉试剂的成分如下：1mmol/ldntp、90ng/μlssb蛋白、120ng/μlreca重组酶蛋白(sc-reca/bs-reca)或30ng/μlrad51、30ng/μlbsudna聚合酶，100mmol/ltricine、20％peg、5mmol/l二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶、exo核酸外切酶。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，对虾肝肠胞虫标准品为含有对虾肝肠胞虫ssu基因部分序列的阳性质粒。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有对虾肝肠胞虫ssu基因部分序列的阳性质粒的序列如seqidno.4所示。本发明还提供了一种对虾肝肠胞虫的raa恒温荧光检测方法，提取待测样品的dna，以待测样品的dna为模板，在对虾肝肠胞虫的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及raa干粉试剂、abuffer、bbuffer和ddh2o存在下进行实时荧光raa反应，根据实时荧光raa扩增曲线分析待测样品；其中所述对虾肝肠胞虫正向引物核苷酸序列如seqidno.1所示、所述对虾肝肠胞虫反向引物核苷酸序列如seqidno.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如seqidno.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述实施荧光raa反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；本发明所述检测方法需要实时荧光raa反应结束后，利用实时荧光raa仪分析软件，根据实时荧光raa的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本fam通道荧光曲线呈“s”型且ct值≤35，判断为对虾肝肠胞虫阳性结果；当待测样本曲线不呈“s”型或ct值＞35，判断为对虾肝肠胞虫阴性结果。有益效果1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链dna的变形等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；3、高特异性：本发明对对虾其他的病症对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒(ihhnv)、对虾急性肝胰腺坏死病(ahpnd)、对虾白斑综合症病毒(wssv)、对虾桃拉综合症病毒(tsv)的dna均不发生扩增。4、高灵敏度：本发明的检测极限可以达到100fg/反应5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。附图说明图1为本发明中涉及的4对引物raa扩增曲线图。图2为raa检测方法对ehp的灵敏度实验图，从左到右依次为100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl的阳性标准品的扩增结果。图3为raa检测方法对ehp的特异性实验图。具体实施方法以下通过具体实施例对本发明进一步说明，但并不局限于此。实施例1：本发明对对虾肝肠胞虫在genebank数据库中搜索对虾肝肠胞虫株ssu基因序列，使用dnaman6.0软件对多序列进行比对，找出保守的区段。在保守区域设计了4组引物和探针，并在ncbi数据库中进行blast比对，引物和探针的序列如表1所示。阳性样本扩增曲线如图1所示。表1引物和探针序列：由图1结果可见，第四组引物和探针的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度(纵坐标值)，且ct值较小(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)结果分析见表2。其它引物探针曲线上升高度较低，ct值较大，平台期不明显；或者没有出现扩增，出现漏检。说明第四组引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。表2引物探针筛选结果分析组别\结果ct值荧光强度第一组14.21330,000第二组17.97170,000第三组15.47380,000第四组12.93560,000实时例2：所述试剂盒对虾肝肠胞虫本发明所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、abuffer、bbuffer、raa干粉试剂、对虾肝肠胞虫标准品和ddh2o。本发明所述的试剂盒，其中，所述的abuffer为20％peg；bbuffer为280mmmgac。本发明所述的试剂盒，其中，所述的raa干粉试剂的成分如下：1mmol/ldntp、90ng/μlssb蛋白、120ng/μlreca重组酶蛋白(sc-reca/bs-reca)或30ng/μlrad51、30ng/μlbsudna聚合酶，100mmol/ltricine、20％peg、5mmol/l二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶、exo核酸外切酶。本发明所述的引物混合液中，所述的正向引物碱基序列如seqidno.1所示，所述反向引物的碱基序列seqidno.2所示，正向引物和反向引物的摩尔配比为seqidno.1：seqidno.2为1:1。本发明提供的对虾肝肠胞虫的特异性探针碱基序列如seqidno.3所示，探针的5’端标记有fam荧光报告基团，3’端标记有bhq1荧光淬灭基团。本发明提供的对虾肝肠胞虫标准品包含有对虾肝肠胞虫保守区基因序列的阳性质粒，该质粒的碱基序列如seqidno.4所示。质粒的碱基序列(seqidno.4):ctgagagatggctcccacgtccaaggatggcagcaggcgcgaaaattgtccactcttttgagaggagacagttatgaaacgtgagtagaagggtcgagtgtaaaaaccttgacgtgaagcaattggagggcaagttttggtgccagcagccgcggtaattccaactccaagagtgtctatggtggatgctgcagttaaagggtccgtagtcgtagatgcaattaaaaggtggtgttaaaagccattgagtttgttgagagtagcggaacggatagggagcatggtataggtgggcaaagaatgaaatctcaagaccccacctggaccaacggaggcgaaagcgatgctcttagacgtatctggggatcaaggacgaaggctagagtatcgaaagtgattagacaccgctgtagttctagcagtaaactatgccgacaatgctgggtgttgcgagagcgatgcttggtgtgggagaaatcttagttttcgggctctggggata实例3：本发明所述试剂盒对虾肝肠胞虫1、阳性样品核酸的提取1.1、核酸提取：采用海洋动物组织dna提取试剂盒进行dna提取。2、raa反应体系的配置：每个检测样品对应一个raa反应干粉管，每个raa反应干粉管中各反应组分和所加入的体积如表3所示。表3:raa反应体系组分体积(μl)abuffer12.5μlbbuffer2.5μl引物混合液4μl特异性荧光探针0.6μldna模板2μlddh2o28.4μl总体积50μlabuffer为20％peg；bbuffer为280mmmgac3、将配置好反应体系的raa反应管放置于abi7500扩增仪中，按照下列程序进行raa扩增：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环。每个循环收集fam通道的荧光。4、扩增结束后根据荧光曲线判断和ct值判定对虾肝肠胞虫阳性或阴性结果。判定结果：fam通道荧光曲线呈“s”型且ct值≤35，判断为对虾肝肠胞虫阳性结果；当待测样本曲线不呈“s”型或ct值＞35，判断为对虾肝肠胞虫阴性结果。实施例4：本发明raa检测试剂盒在临床实际应用中的评估采用本发明试剂盒进行临床盲样的实验，检测500份对虾；实验结果表明，本发明的第四引物对可以区分出虾肝胞虫，与巢式pcr阳性符合率很高。在500份中，巢式pcr，有318份为阳性结果，182份为阴性结果，通过raa方法检测的结果为319份为阳性，有181份也为阴性结果，存在一份阳性结果不同，对这个样本dna进行pcr扩增并测序，测序结果显示该样本为阳性，说明本发明的raa检测试剂有更高的准确率。试验例5：本发明所述试剂盒的灵敏度试验本发明实施例2所述试剂盒提供的对虾肝肠胞虫标准品质粒，提取阳性质粒，并用nanodrop测量阳性质粒的浓度，并将其分别稀释到100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl5个浓度梯度进行灵敏度试验。检测结果如图2所示，从左到右依次为100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的raa荧光扩增试剂和检测的灵敏度可达100fg/μl，精确性优于普通pcr检测方法，表明本发明的raa恒温荧光检测试剂盒和检测方法对ehp的诊断具有高度的灵敏性。试验例6：本发明所述试剂盒的特异性试验为了检测本发明试剂盒的特异性，采用实例3中的检测方法，分别对病毒wssv、ihhnv、ehp、ahpnd、tsv样本进行检测，分析本试剂盒对ehp和对虾其他常见病毒的检测情况。检测结果表明：仅ehp样品出现正常扩增，阴性对照(ddh2o)及ihhnv、wssv、ahpnd、tsv样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明，本发明raa恒温荧光检测试剂盒能特异性扩增出ehp中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。同时，采用本发明设计的1-3对引物进行同样的特异性实验，发现这些引物不能很好的特异区分不同的样本，特异性不是很好(具体实验数据略)。在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。序列表<110>杭州众测生物科技有限公司<120>虾肝肠胞虫（ehp）的raa恒温荧光检测方法及试剂<130>17-100070-00002919<141>2017-11-10<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gaggagacagttatgaaacgtgagtagaag30<210>2<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2catgctccctatccgttccgctactctcaac31<210>3<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aattccaactccaagagtgtctatggtggagcgcagttaaagggtcc47<210>4<211>502<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctgagagatggctcccacgtccaaggatggcagcaggcgcgaaaattgtccactcttttg60agaggagacagttatgaaacgtgagtagaagggtcgagtgtaaaaaccttgacgtgaagc120aattggagggcaagttttggtgccagcagccgcggtaattccaactccaagagtgtctat180ggtggatgctgcagttaaagggtccgtagtcgtagatgcaattaaaaggtggtgttaaaa240gccattgagtttgttgagagtagcggaacggatagggagcatggtataggtgggcaaaga300atgaaatctcaagaccccacctggaccaacggaggcgaaagcgatgctcttagacgtatc360tggggatcaaggacgaaggctagagtatcgaaagtgattagacaccgctgtagttctagc420agtaaactatgccgacaatgctgggtgttgcgagagcgatgcttggtgtgggagaaatct480tagttttcgggctctggggata502<210>5<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gagaggagacagttatgaaacgtgagtagaag32<210>6<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctatccgttccgctactctcaacaaactcaatg33<210>7<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aattccaactccaagagtgtctatggtggagcgcagttaaagggtcc47<210>8<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gagaggagacagttatgaaacgtgagtagaag32<210>9<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ctataccatgctccctatccgttccgctactctc34<210>10<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aattccaactccaagagtgtctatggtggagcgcagttaaagggtcc47<210>11<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gaggagacagttatgaaacgtgagtagaag30<210>12<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ctatccgttccgctactctcaacaaactcaat32<210>13<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13aattccaactccaagagtgtctatggtggagcgcagttaaagggtcc47当前第1页12