一种脂溶性光敏剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种脂溶性光敏剂及其制备方法和应用，属于医疗及生物医学领域。。

背景技术：

皮肤鳞癌是皮肤肿瘤的一种。其主要特征是：初起为疵状隆起肿块，基底坚硬，表面粗糙如菜花状，可见毛细血管扩张，顶部常见钉刺样的角质。皮肤鳞癌合并感染有黏稠脓液，伴恶臭、疼痛。其恶性度较高，较易转移，多见区域性淋巴结转移，严重影响患者身心健康。

光动力疗法(photodynamictherapy，pdt)的抗癌原理是一种主要影响目标组织，具有双重选择性的治疗方式。其双重选择性是基于光敏剂在正常组织和目标组织中浓度的差异，以及通过空间限制和聚焦的方式使光对目标组织直接照射。光敏剂在注射3-96小时后积聚在目标组织，具体时间取决于所用光敏剂。在积聚期间，用光直接照射目标组织以活化光敏剂，活化的光敏剂将能量传递给基态氧(3o2,3∑g-)从而形成各种形式的活性氧，损伤肿瘤细胞重要的结构和功能，进而导致肿瘤组织的破坏。与手术、化疗、放疗等常规治疗手段相比，肿瘤光动力疗法具有如下重要优点：1)创伤小。2)毒性低微:进入组织的光动力药物，只有达到一定浓度并受到足量光辐照，才会引发光毒反应杀伤肿瘤细胞。3)选择性好。4)可保护容貌及重要器官功能。

现有的光动力疗法的副作用常为光过敏反应，同时光动力反应有一定的滞后性和不可控性，虽然靶向性高，但是其反应速度与程度难以控制，导致副反应较多，疗效较差。表现为皮肤局部出现红疹或水泡，如中国发明《光敏剂在痤疮治疗中的应用》，申请号：201310097473.3，采用的光敏剂对于痤疮治疗后治疗部位出现局部的暂时的反应性水肿，并伴随疼痛，均是由于皮肤愈合不良导致。其次，现有的光敏剂在皮肤肿瘤组织的聚集浓度还有待提高，如中国发明《光敏剂叶绿酸钠盐衍生物及其制备方法和用途》，申请号：201210169784.1；采用的叶绿酸钠盐衍生物与传统光敏剂结合，尽管水溶性叶绿酸钠盐增强了光敏剂的渗透能力，但由于其脂溶性不强，使光敏剂在肿瘤组织中富集浓度和存留时间就受到极大限制，仍然难以达到良好的治疗效果。

为解决上述问题，本发明首次设计出基于维生素e衍生物的光敏剂，维生素e作为一种功能强大的脂溶性维生素，被广泛使用在美肤产品中，具有以下优势：1)能清除自由基，具有抗氧化作用；2)能维持酶活性，增加线粒体和生物膜的功能，使细胞膜不受氧化破坏；3)其能稳定细胞膜的蛋白活性结构，促进肌肉的正常发育及保持肌肤的弹性；4)维生素e为脂溶剂，能够滋润皮肤，改善局部血液循环和组织营养状况，保护修护皮肤。本发明同时利用维生素e衍生物含有较多氧原子、具有双极性和可以促进皮肤愈合修复等特点，极大地提高了光敏剂在肿瘤组织富集浓度及存留时间，实现高效光动力治疗的同时，也减小了光动力对周围健康皮肤的损害和促进治疗部位皮肤的愈合。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种本一种副作用小、见效快的新型的一种含有维生素e片段的脂溶性光动力外用制剂，通过光动力利用氧化应激治疗皮肤鳞癌。

本发明的技术方案是，提供一种脂溶性光敏剂，该脂溶性光敏剂的结构式为：

其中r为k或na。

本发明还提供上述脂溶性光敏剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将1-萘胺与含氯化合物在55℃-60℃的乙醇溶剂中反应，得到中间产物a，其反应式为：

将四羧基化合物与koh或naoh溶液反应，得到中间产物b；

(2)将中间产物a与中间产物b按2-2.5：3-4的摩尔比在乙醇溶剂中反应，得到中间产物c，反应式为：

(3)将维生素e与中间产物c在丙酮溶剂中反应，得到脂溶性光敏剂，反应式为：

，步骤(1)合成中间产物a的反应中，1-萘胺与含氯化物的摩尔比为1-2:2-2.5，反应时间为4-5分钟。

优选地，步骤(1)合成中间产物b的反应中，以丙酮或苯为反应溶剂，温度为45-50℃。

优选地，步骤(2)合成中间产物c反应中，在60-63℃的乙醇溶剂中反应20-30分钟。

优选地，步骤(3)合成脂溶性光敏剂反应中，中间产物c与维生素e的摩尔比为1:1。

本发明还提供上述脂溶性光敏剂在制备抗肿瘤药物方面的应用。

优选地，在抗肿瘤药物中，所述脂溶性光敏剂的重量百分含量为0.0005％～0.0020％。

优选地，在抗肿瘤药物中，所述脂溶性光敏剂的重量百分含量为0.0015％。

优选地，所述抗肿瘤药物为抗皮肤肿瘤药物，特别是抗上皮来源肿瘤药物。

所述光敏剂的使用剂量为20～50mg/kg，光敏剂的组合物中的重量百分含量为0.0005％～0.0020％，优选0.0015％。所述制剂包含脂溶性维生素和药物上可接受的赋形剂或辅料。所述辅料或赋形剂包括但不限于甘露醇、亚硫酸氢钠、淀粉、糊精粉、无水乙醇、注射用水、糖粉、乳糖、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁、蔗糖、聚维酮k30中的任意一种或多种。

所述激发包括光敏剂的组合物的光是紫外线或可视光，优选红光。

所述光所用的光源为：超音波照射发生器、光发射电子管、激光电子管、燃料激光、卤族金属灯、闪光灯、机械滤过的荧光光源、日光或机械滤过的日光、或白热线光源中的一种或多种。

光激发包括本光敏剂的组合物时，对光波长没有限制，考虑到穿透效果，优选波长在380-780nm的红光。光强度范围优选1～100j/cm²，最佳范围是1～20j/cm²。

除照射强度外，对照射时间也没有限制。要想达到效果好且对正常皮肤无损伤的条件，除了有最佳的照射光强度外，照射同样也有最佳照射时间，最佳照射时间为10min～15min,光照射次数为1次。

所述包括光敏剂的组合物以液体、半固体、固体或者气雾剂形态使用。例如水溶性或者非溶性浑悬液、溶液、啫喱、乳剂(包括膏霜)、软膏、凝胶、浆液、栓剂、片剂、胶囊或者细微喷雾剂等形态被使用。

所述皮肤肿瘤，其主要特征是：初起为疵状隆起肿块，基底坚硬，表面粗糙如菜花状，可见毛细血管扩张，顶部常见钉刺样角质。

所述包括脂溶性维生素e的光敏剂组合物在光照射时被激化，通过激活erk、jnk和p38信号通路，促进肿瘤细胞产生氧化应激诱导细胞凋亡，对皮肤肿瘤具有很好的疗效。

本发明有益效果为：将维生素e衍生物及它们的无机盐和光敏剂结合用于皮肤肿瘤治疗，其治疗效果显著，借助维生素e对健康皮肤的保护作用，可以帮助皮肤胶原纤维修复，极大地减少药物副作用，但不损坏正常细胞，含有维生素e衍生物的光敏剂能够产生更多的自由基，减少副作用且具有较高治疗浓度能高效快速杀死皮肤肿瘤，更加高效快速杀死肿瘤细胞，剂量远低于市场上用的5-ala，不含抗生素、不产生耐药性、安全无毒且经济实用。

附图说明

图1表示脂溶性光敏剂的化学结构式。

图2表示脂溶性光敏剂的氢谱图。

图3表示脂溶性光敏剂的碳谱图。

图4表示梯度浓度光敏剂对a431鳞癌细胞存活的影响。

图5表示梯度浓度光敏剂对a431鳞癌细胞存活率影响定量统计图。

图6表示a431鳞癌细胞流式细胞结果图。

图7表示光敏剂处理后凋亡相关蛋白westernblot结果图。

图8表示光敏剂处理后caspase-3和bcl-2westernblot结果图。

图9表示光敏剂处理前后肿瘤组织病理切片图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：脂溶性光敏剂的合成路线如下：

(1)将1-萘胺与含氯化合物在55℃-60℃的乙醇溶剂中反应，得到中间产物a，其反应式为：

将四羧基化合物与koh或naoh溶液反应，得到中间产物b；

(2)将中间产物a与中间产物b按2-2.5：3-4的摩尔比在乙醇溶剂中反应，得到中间产物c，反应式为：

(3)将维生素e与中间产物c在丙酮溶剂中反应，得到脂溶性光敏剂(图1)，反应式为：

以下为终产物的氢谱(图2)和碳谱(图3)，证明了本发明成功地获得了上述目标产物。

实施例2：含有维生素e片段的长效脂溶性光动力外用制剂抑制皮肤肿瘤细胞活性测试

mtt法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

(1)实验方法

鳞癌细胞a-431细胞系培养于10％小牛血清的dmem培养液中，添加100iu/l的青霉素和100mg/l的链霉素，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，pbs液冲洗两次，再用0.25％的胰酶和0.02％的edta消化5分钟，再分瓶培养，2至3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％co2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，分别加入蒸馏水、100nm、200nm、400nm、600nm和800nm上述含有维生素e片段的长效脂溶性光动力制剂，孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，16h后用mtt法检测细胞存活和生长的状态。

(2)实验结果

mtt实验结果显示，含有维生素e片段的长效脂溶性光动力制剂能明显抑制a-431细胞活性，并且随着剂量的加大对细胞活性的抑制效果增加，在含有维生素e片段的长效脂溶性光动力制剂800nm时抑制效果能达到76％(图4和图5)。

实施例3：含有维生素e片段的长效脂溶性光动力制剂使皮肤肿瘤产生凋亡实验

annexinv是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸(ps)由脂膜内侧翻向外侧。因此annexinv是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。pi(碘化丙啶)是一种可对dna染色的细胞核染色试剂，尽管pi不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。因此annexinv和pi联合使用能同时对活细胞和死细胞染色。

(1)实验方法

鳞癌细胞a-431细胞系培养于10％小牛血清的dmem培养液中，添加100iu/l的青霉素和100mg/l的链霉素，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，pbs液冲洗两次，再用0.25％的胰酶和0.02％的edta消化5分钟，再分瓶培养，2至3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％co2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，照光组分别加入400nm上述含维生素e片段制剂，400nm上述含维生素e片段制剂+nac(乙酰半胱氨酸)，400nm上述含维生素e片段制剂+gsh(谷胱甘肽)，100μmh2o2，100μmh2o2+nac和100μmh2o2+gsh孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，另外不照光组分别加入蒸馏水和400nm上述含维生素e片段制剂，16h后用照光组和不照光组分别用annexinv–pi染色，通过facscaliburflowcytometer观察细胞发生凋亡的情况。

(2)实验结果

流式检测结果显示，400nm上述含维生素e片段制剂不照光对细胞并未对a-431细胞产生细胞毒作用。而经过400nm含维生素e片段制剂-pdt处理后16h产生的细胞凋亡比空白组增加24％(图6)，抗氧化剂nac和gsh能明显挽救含维生素e片段制剂-pdt对a431细胞的杀伤作用，挽救效果达到4.83％和12.55％。从结果分析，400nm含维生素e片段制剂-pdt能明显诱导细胞产生凋亡，并且氧化应激参与了400nm含维生素e片段制剂-pdt对细胞的杀伤作用。

实施例4：含维生素e片段长效脂溶性光动力外用制剂激活皮肤肿瘤细胞mapk信号促进细胞凋亡实验

mapk信号参与细胞对辐射、渗透压、温度变化、氧化应激等应激反应，调控细胞增殖、凋亡和坏死。caspase-3和bcl-2是细胞凋亡的重要指标，caspase-3表达增加和bcl-2表达量的抑制是细胞产生凋亡的重要标志。

(1)实验方法

鳞癌细胞a-431细胞系培养于10％小牛血清的dmem培养液中，添加100iu/l的青霉素和100mg/l的链霉素，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，pbs液冲洗两次，再用0.25％的胰酶和0.02％的edta消化5分钟，再分瓶培养，2至3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％co2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，在每孔中分别加入蒸馏水，100μmh2o2，400nm含维生素e片段制剂和egf，孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，半小时后收集细胞提取总蛋白用westernblot法检测细胞中p-erk、p-jnk和p-p38的表达。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于培养皿中，置于5％co2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，照光组分别加入400nm含维生素e片段制剂，400nm含维生素e片段制剂+nac(乙酰半胱氨酸)，400nm含维生素e片段制剂+gsh(谷胱甘肽)，100μmh2o2，100μmh2o2+nac和100μmh2o2+gsh孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，半小时后提取蛋白，另外不照光组分别加入蒸馏水和400nm含维生素e片段制剂，半小时后提取蛋白，分别用westernblot法检测细胞中p-erk、p-jnk和p-p38的表达。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于培养皿中，置于5％co2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，照光组分别加入100nm、200nm、400nm含维生素e片段制剂，100nm、200nm、400nm含维生素e片段制剂+nac(乙酰半胱氨酸)，100nm、200nm、400nm含维生素e片段制剂+gsh(谷胱甘肽)，100μmh2o2，100μmh2o2+nac和100μmh2o2+gsh孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，16小时后提取蛋白，另外不照光组分别加入蒸馏水和400nm含维生素e片段制剂，16小时后提取蛋白，分别用westernblot法检测细胞中caspase-3的表达量。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于5％co2培养箱，37℃培养，待生长至80％～90％融合状态时，加入400nm含维生素e片段制剂药剂孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，16h后用收集细胞进行免疫荧光染色，观察细胞caspase-3和bcl-2的表达量。

(2)实验结果

400nm含维生素e片段制剂-pdt处理a-431细胞能明显激活p-erk，p-jnk和p-p38信号，其效果优于100μmh2o2(图7)表示400nm光敏剂对凋亡信号通路的激活强于h2o2。

同时100nm、200nm、400nm含维生素e片段制剂-pdt能明显增加caspase-3的表达。双氧水明显增加caspase-3，而抗氧化剂nac和gsh反转了结果。抗氧化剂nac和gsh在不同程度上抑制了含维生素e片段制剂-pdt诱导的caspase-3增加。免疫荧光染色结果同样说明含维生素e片段制剂-pdt明显增强caspase-3的表达，同时抑制了bcl-2的表达(图8)。说明本发明涉及的含有维生素e片段的光敏剂可以有效地激活鳞癌肿瘤细胞的细胞凋亡途径，从而促进癌细胞的死亡。并且，“细胞凋亡”这一程序性的死亡过程，是细胞自动的死亡，对周边正常组织的影响十分微弱，光动力的副反应也大大降低。

实施例5：含维生素e片段制剂-pdt治疗鳞癌荷瘤小鼠实验

(1)动物实验

小鼠鳞状细胞瘤模型，选用裸鼠，雄性，18-20g。实验时，取生长良好的a-431细胞，经胰酶消化后用无菌生理盐水按1:10比例稀释后制成肿瘤细胞悬液，于裸鼠左侧肿瘤经皮下注射300μm含维生素e片段制剂，右侧肿瘤不处理作为对照，用20j/cm²的红光照射15min，于处理后第7天收集肿瘤组织进行组织切片观察肿瘤情况。

(2)实验结果

300μm含维生素e片段制剂-pdt处理后第七天可以看到，处理组肿瘤组织块(500μm-pdt)明显比对照组(ctrl)小，结果说明含维生素e片段制剂-pdt能明显清除肿瘤块细胞，对皮肤鳞癌有明显的治疗效果(图9)。并且对比肿瘤组织和周边健康组织，相比对照组(ctrl)，经本发明所涉及光明剂处理后，新生的修复细胞各层次排列更紧密，细胞生长更旺盛，与肿瘤组织界限更清，结果说明本发明涉及的一种脂溶性长效光敏剂对肿瘤组织的杀伤毁灭作用具有较高特异性，光动力反应后周围正常组织损伤较小。且坏死后的原肿瘤组织区域的修复和愈合也更快，预后效果更好。