本发明属于葡萄分子育种领域，具体提供了一种葡萄果实无核主效qtl位点的ssr分子标记。
背景技术：
葡萄（vitisviniferal.）属于葡萄科葡萄属浆果，它是我国第二大栽培果树，可以广泛地应用于酿酒、鲜食、制汁、制干。其中，无核葡萄占据首要地位。无核葡萄果汁丰富，含糖量高，食用方便，品质优良，深受广大消费者喜爱。在发达国家，有超过50%消费的鲜食和制干葡萄是无核葡萄。在我国，新疆是葡萄主产区，且大部分是无核葡萄品种。因此，无核葡萄育种成为葡萄育种的主要目标之一。
在无核葡萄品种选育上，主要途径是常规杂交育种，通常使用有核品种作母本，无核品种作父本的组合。但是，常规的杂交育种周期长，后代选育率低，大大阻碍了无核葡萄育种的进程。近几年，分子标记的不断发展，给无核葡萄选育提供了便利。利用分子标记对杂种后代进行早期的无核性状鉴定，极大地加速了无核葡萄的育种进程。
目前利用分子标记辅助育种进行葡萄无核性状的研究已有报道，其中ssr标记vmc7f2被广泛研究。j.a.cabezas等人在‘赤霞珠’ב秋无核’的118株杂交子代中定位到了与葡萄无核性状相关联的qtl位点sdi，与该位点紧密连锁的分子标记vmc7f2在198bp等位点上能对后代的无核性状进行有效的分离，其对表型的解释率为50%。但是，在研究的‘红地球’与‘森田尼无核’群体中，用vmc7f2标记的引物对扩增两亲本的基因组dna，结果显示，两亲本的扩增产物间几乎无差别。
技术实现要素：
本发明的目的是筛选葡萄果实无核主效qtl位点的ssr分子标记，提供葡萄果实无核主效qtl位点的ssr分子标记的引物对，利用该引物对检测葡萄果实无核性状。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种葡萄果实无核主效qtl位点的ssr分子标记vvsd10，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
上述葡萄果实无核主效qtl位点是以母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’构建的遗传连锁图谱为基础，结合父母本及其f1代群体果实的有无核表型定位得出的，该位点位于第18连锁群上，贡献率为77.9%。
本发明还提供一种葡萄果实无核主效qtl位点的ssr分子标记vvsd10的引物对，其正向引物序列如seqidno.2所示，即：5'-agagctcatttggattaagagcgagtaattatattgt-3'；其反向引物序列如seqidno.3所示，即5'-ggaaaaatccatcgctaacaaagtattaattctcttca-3'。
本发明还提供了一种检测葡萄果实无核性状的方法，包括以下步骤：用上述引物对扩增待检测葡萄样本和有核、无核对照样本的全基因组dna，利用hrm技术分析扩增产物，若扩增产物的熔解曲线与无核对照样本颜色一致，则代表待检测葡萄样本果实无核。
上述方法中，hrm技术的pcr反应体系为15µl：1.6µl浓度为3µmol/l的mgcl2，7.5µl的2×hrmmastermix，浓度为10µm的正反向引物各1µl，10ng模板dna，加无菌蒸馏水至15µl。
上述方法中，hrm技术的pcr反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，62℃复性15s，72℃延伸10s，共48个循环，升温和降温过程中温度变化率分别为4.4℃/s和2.2℃/s。
上述方法中，hrm技术的分析过程为：95℃变性1min，40℃杂交1min，65～95℃读取熔解曲线，温度变化率为1℃/s。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明确定了葡萄果实无核性状的主效qtl位点，该位点贡献率为77.9%，基于该位点筛选到了连锁的ssr分子标记。
2.本发明筛选的葡萄无核主效qtl位点的ssr分子标记vvsd10，可用于母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’f1代群体无核性状的检测，检测正确率达56.44%。
附图说明
图1为分子标记vmc7f2的引物对在母本‘红地球’中的扩增产物的毛细管电泳图；横轴代表片段大小（bp），纵轴代表峰的高度（cm）；
图2为分子标记vmc7f2的引物对在父本‘森田尼无核’中的扩增产物的毛细管电泳图；横轴代表片段大小（bp），纵轴代表峰的高度（cm）；
图3为分子标记vvsd10的引物对在母本‘红地球’中的扩增产物的毛细管电泳图；横轴代表片段大小（bp），纵轴代表峰的高度（cm）；
图4为分子标记vvsd10的引物对在父本‘森田尼无核’中的扩增产物的毛细管电泳图；横轴代表片段大小（bp），纵轴代表峰的高度（cm）；
图5为分子标记vvsd10的引物对在母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’f1代群体中的扩增产物的高分辨率熔解曲线图；横轴代表熔解曲线温度，纵轴代表相对荧光强度；a区为母本‘红地球’及与其熔解曲线颜色一致的子代样本，b区为父本‘森田尼无核’及与其熔解曲线颜色一致的子代样本。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1葡萄果实无核主效qtl位点的ssr分子标记的获得
（1）将母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’进行杂交，获得131株f1代群体；
（2）对两个亲本及131株f1代群体进行rad-seq测序（限制性酶切位点关联dna测序）；首先提取两个亲本和131株f1代群体每个个体的基因组dna，质量检测后进行酶切，电泳回收所需长度的dna片段，加上接头进行cluster制备，上机测序；然后运用soap比对软件将测序序列比对到参考基因组序列上（ncbi-gcf-000003745.3-12x）；根据soap比对结果，运用samtools软件生成casfs软件所需的pileup和glf文件，利用casfs软件鉴定群体中每个位点的情况，过滤获得亲本之间的有效snp集；由于snp数量多，采用窗口滑动的方法，选择以每15个snp为一个窗口，每次滑动一个snp，确定每个窗口的基因型以及每个个体的交换位点，得到每个个体的基因型并生成bin图；对生成的bin图采用拟测交的方式，利用joinmap软件进行连锁分析，构建‘红地球’与‘森田尼无核’遗传连锁图谱；
（3）在果实成熟期，统计母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’的131个f1代群体果实的有无核情况；
（4）将f1代群体的有无核情况与步骤（2）中构建的遗传连锁图谱进行遗传连锁和qtl分析，在遗传连锁图谱的第18连锁群上检测到果实无核性状的qtl位点，该位点的定位区间在26835846～26960426，位于葡萄基因组18号染色体上，在定位区间内表型与基因型有很好的共分离；该qtl位点lod值为26.3，贡献率为77.9%，是主效qtl；
（5）根据步骤（4）中所得到的qtl位点的定位区间，用perl语言找到了符合ssr序列特征的35个ssr分子标记，利用primerpremier5.0软件设计35个ssr分子标记的引物对，通过hrm（高分辨率熔解曲线分析）技术筛选到了在亲本之间存在差异的一对引物对，将其在父本中的扩增产物命名为vvsd10，并将其作为鉴定葡萄果实无核性状的标记。
hrm技术包括pcr扩增和hrm分析过程，hrm技术的pcr反应体系为15µl：1.6µl浓度为3µmol/lmgcl2，7.5µl的2×hrmmastermix，浓度为10µm的正反向引物各1µl，10ng模板dna，加无菌蒸馏水至15µl；pcr反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性10s，62℃复性15s，72℃延伸10s，共48个循环；升温和降温过程中温度变化率分别为4.4℃/s和2.2℃/s；hrm分析过程为：95℃变性1min，40℃杂交1min，65～95℃读取熔解曲线，温度变化率为1℃/s。
实施例2葡萄果实无核性状的早期检测
苗期提取‘母本‘红地球’、父本‘森田尼无核’及两亲本杂交f1代群体的全基因组dna作为模板，以分子标记vvsd10的引物对作为扩增引物，利用hrm（高分辨率熔解曲线分析）技术进行检测分析；以母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’的熔解曲线作对照，若子代的熔解曲线与母本的熔解曲线颜色一致，则预测子代样本果实有核，若子代的熔解曲线与父本的颜色一致，则预测子代样本果实无核；结果显示，在131个f1代群体中，有101个子代个体的熔解曲线颜色与父本一致，存在分子标记vvsd10。
果实成熟期，对f1代群体的果实表型进行检测，结果显示，上述101个检测到分子标记vvsd10的个体中，有57个果实无核，有44个果实有核，分子标记vvsd10检测果实无核性状正确率为56.44%。
上述分子标记vvsd10的正向引物序列为5'-agagctcatttggattaagagcgagtaattatattgt-3'，反向引物序列为5'-ggaaaaatccatcgctaacaaagtattaattctcttca-3'。
sequencelisting
<110>中国农业科学院郑州果树研究所
<120>葡萄果实无核主效qtl位点的ssr分子标记
<130>无
<160>3
<170>patentinversion3.5
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<212>dna
<213>人工序列
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ggaaaaatccatcgctaacaaagtattaattctcttcaacaaatggtttgttccgtgtgt60
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<212>dna
<213>人工序列
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