烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1及其dsRNA在害虫防治中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1及其dsrna在害虫防治中的应用。

背景技术：

烟草甲lasiodermaserricorne（fabricius），属鞘翅目（coleoptera）窃蠹科（anobiidae），是一种世界性的仓储害虫。该虫寄主范围广泛，可危害烟草、粮食、香料、茶叶、中药材等多种储藏物。烟草甲主要通过幼虫潜居寄主体内进行蛀食，排出大量粪便、留下虫尸、产生异味，严重影响储藏物的产量和品质，其发生危害具有较强的隐蔽性。目前烟草甲的防治主要以化学药剂熏蒸为主，不仅带来食品安全和人类安全隐患，而且导致其对杀虫剂产生了不同程度的抗药性，需要探索新的仓储害虫防治策略。

rna干扰属于反向遗传学范畴，通过体外合成一段与靶基因同源的dsrna或sirna，导入生物体内，使内源性靶基因中同源mrna降解，从而达到阻抑基因表达的目的。rna干扰是昆虫基因功能研究的有效手段，它的成功应用为一系列新颖的、环境友好的害虫防治策略提供理论依据。rna干扰在害虫控制中具有杀虫专一性高和无残留等特点，目前美国孟山都公司rna干扰技术已被美环保署批准作为杀虫剂使用。

几丁质是昆虫外骨骼和中肠围食膜的主要组成成分，对昆虫表皮和围食膜的结构形态和大小维持具有重要的作用。昆虫的生长发育必须经历周期性去旧表皮和合成新表皮，这一过程依靠生物体内几丁质生物合成和降解的精确控制。几丁质脱乙酰酶是参与几丁质降解的关键酶，调节昆虫的行为、变态发育及生殖等。通过扰乱或阻断昆虫几丁质脱乙酰酶的形成，使得昆虫蜕皮发育出现紊乱，导致其生理机能严重障碍以致昆虫不能完成正常的生命活动而死亡。由于几丁质不存在于人和其他高等动物中，针对几丁质筛选的分子靶标用于害虫防治相对安全。因此，基于几丁质降解途径作为靶标开发害虫特异的、新型杀虫剂，在植物保护领域具有潜在的应用价值。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1以及该基因编码的氨基酸，本发明的另一个目的是提供一种烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段以及该基因片段的获取方法，本发明的第三个目的是提供一种烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段合成的dsrna以及获取该dsrna的方法，本发明的第四个目的是提供一种烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段合成的dsrna在烟草甲防治中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1的核苷酸序列为seqidno：1；该核苷酸序列是基于烟草甲转录组数据库搜索获得的片段进行拼接比对后，设计上游引物seqidno：3和下游引物seqidno：4，通过pcr扩增获得。该核苷酸序列长度为1614bp。烟草甲几丁质脱乙酰酶1基因编码的氨基酸序列为seqidno：2；该氨基酸序列获得是采用expasy在线软件将所述核苷酸序列seqidno：1翻译为相应的氨基酸并对其蛋白特性进行预测。结果表明几丁质脱乙酰酶基因1的编码537个氨基酸，相对分子量为61.07kd，理论等电点为4.78。

本发明提供的烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段以及该基因片段的获取方法：基于烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1的核苷酸序列，利用primerpremier5.0软件分别设计含有t7启动子的上游引物seqidno：5和下游引物seqidno：6，通过pcr扩增获得一段长度为474bp的两端均为t7启动子的dna片段，该dna片段的核苷酸序列为seqidno：7。

本发明提供的烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段合成的dsrna以及获取该dsrna的方法：将核苷酸序列为seqidno：7的基因片段的pcr产物纯化，以该纯化产物为模板按照transcriptaidt7highyieldtranscriptionkit（thermo）试剂盒说明体外转录合成dsrna。

本发明提供的烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段合成的dsrna在烟草甲防治中的应用：利用微量注射器将dsrna导入烟草甲体腔内，检测dsrna对几丁质脱乙酰酶基因1的mrna表达，并观察dsrna对烟草甲生长发育的影响。结果表明：注射dsrna后烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1的mrna表达量显著降低，同时dsrna影响烟草甲蜕皮发育，虫体出现表皮黑化、皱缩且蜕皮困难导致死亡。

与现有技术比较，本发明由于采用了上述技术方案，因此具有以下优点：烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段合成的dsrna对烟草甲具有致死作用，表现为注射特异性dsrna后，虫体出现表皮黑化、皱缩且蜕皮出现困难并导致死亡，死亡率达到76%以上。本发明的烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1合成的dsrna对烟草甲具有高的致死率，为筛选高效分子靶标提供便利，可为害虫防治提供新的途径。

附图说明

图1是5龄幼虫烟草甲注射seqidno:7合成的dsrna后几丁质脱乙酰酶基因1的mrna表达量，ef1α作为内参基因；*p＜0.05，**p＜0.01。

图2是5龄幼虫烟草甲注射seqidno:7合成的dsrna出现表皮黑化、皱缩且蜕皮困难而死亡的表型；左侧为注射dsgfp的对照，右侧为注射seqidno:7合成的dsrna。

图3是5龄幼虫烟草甲注射seqidno:7合成的dsrna后的累积存活率；其中，dsgfp表示对照组，dslscda1表示实验组。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明，具体如下：

实施例1：烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1全长cdna序列及编码氨基酸

1）烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1的鉴定

采用生物信息学方法从烟草甲转录组数据库中对几丁质脱乙酰酶基因1进行搜索，使用ncbi数据库中blastx进行同源性分析，确定筛选获得1条烟草甲几丁质脱乙酰酶1基因全长序列。

2）烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1全长cdna验证

基于上述的烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1的序列，采用primerpremier5.0软件设计特异性全长引物，其中上游引物seqidno：3和下游引物seqidno：4。引物合成由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。

取20头烟草甲5龄幼虫于液氮内速冻，然后放在研钵中磨碎成细粉，转移入无rna酶离心管中，加入1mltrizol试剂，提取总rna，具体步骤参见trizol试剂盒说明书。按照takara公司primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒的说明书进行第一链cdna的合成。以上述得到的cdna为模板，结合设计上下游引物（seqidno:3和seqidno：4）进行pcr扩增获得几丁质脱乙酰酶基因1的全长序列，通过gelextractionminikit（omega）试剂盒进行pcr产物回收。将纯化的dna连接到pgem-teasy（promega）载体上，后转入dh5α大肠杆菌感受态细胞（全式金公司），经蓝白斑筛选和pcr鉴定后，将阳性克隆500μl的菌液送送往成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，其余菌液采用plasmidminikit（omega）提取质粒并保存于-20℃冰箱中备用。测序得到几丁质脱乙酰酶基因1的全长序列为1614bp，其核苷酸序列为seqidno：1所示。

3）烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1编码氨基酸预测

采用expasy在线软件对已获得的seqidno：1序列进行编码氨基酸预测，结果显示，烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1的开放阅读框为1614bp，编码537个氨基酸，相对分子量为61.07kd，理论等电点为4.78。烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1编码氨基酸与同为鞘翅目的赤拟谷盗同源氨基酸序列比较，相似性达到93%。

实施例2：烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段dsrna合成

基于烟草甲seqidno：1全长序列，利用primerpremier5.0软件分别设计含有t7启动子的上游引物taatacgactcactatagggacctctgttgtatactgatg（seqidno：5）和下游引物taatacgactcactatagggcgttcatcatcattgtgagt（seqidno：6）（t7启动子序列以斜体所示），引物合成由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。将实例一中全长cdna验证过程中冻存的质粒解冻稀释后作为模板，利用上述设计的dsrna引物进行pcr扩增，获得一段长度为474bp的两端均为t7启动子的dna片段，其序列为seqidno：7所示。试剂盒纯化后的pcr产物作为模板用于dsrna合成，采用transcriptaidt7highyieldtranscriptionkit(thermo)试剂盒体外转录合成dsrna。dsrna浓度采用nanovueuv-visspectrophotometer(gehealthcarebio-science)测定，将终浓度调整为2.5μg/μl于-80℃超级低温冰箱中备用。

实施例3：烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段dsrna注射致死5龄幼虫

1）烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1片段dsrna注射

选取5龄第三天大小均一、健康状况一致的幼虫用于注射上述合成的dsrna。利用微量注射器nanojectiiauto-nanoliterinjector（drummondscientific）用于注射，注射点位于幼虫背部第一或第二节节间，轻微操作，顺着体液流动的方向。注射dsrna的量为0.2-0.3μg，并设置dsgfp的对照组，每组50头幼虫，3个生物学重复，共计150头。注射完毕后，将虫子置于人工气候室（温度27±1°c、相对湿度为70±5%、光周期l:d=14:10h），用人工饲料进行饲养。

2）烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1的沉默效率检测

对烟草甲5龄幼虫dsrna注射后靶标基因的沉默效率检测，选择72h、120h后整虫虫体作为rna提取对象，每组设置3个生物学重复。提取各样品的总rna并反转录成cdna，用实时荧光定量检测目的基因（lscda1）和内参基因（ef1α）的相对表达量，以计算目的基因的沉默效率（图1）。结果表明，在3-5d后，烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1在注射相应的dsrna的实验组中的相对表达量相对于对照组（gfp）显著下调，而且下调高达85%左右，如图1所示。

3）dsrna对5龄幼虫蜕皮发育的影响

5龄第三天幼虫注射dsrna后，注射dsgfp对照组3天后开始蜕皮并全部成功化蛹，羽化至成虫后虫体形态活力正常。注射dslscda1的处理组幼虫共150头，有76%不能正常化蛹，最终死亡，表型如图2所示：虫体共出现三种致死表型，其中10%的虫体出现全体黑化并皱缩；26%的出现半黑化并皱缩；44%的虽无黑化现象，但虫身皱缩，蜕皮困难致死。通过观察发现，几丁质脱乙酰酶基因1的dsrna处理的实验组的烟草甲无法正常蜕皮导致死亡，死亡率达76%以上（结果如图3所示）。

序列表

<110>贵阳学院

<120>烟草甲几丁质脱乙酰酶基因1及其dsrna在害虫防治中的应用

<141>2017-11-13

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