一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的LAMP检测试剂盒及检测引物的制作方法

本发明涉及中华鳖疾病检测技术领域，特别涉及一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的lamp检测试剂盒及检测引物。

背景技术

中华鳖是一种名贵、经济价值很高的水生动物。在动物分类上，中华鳖属脊索动物门、脊索动物亚门、爬行纲、无孔亚纲、龟鳖目、曲颈龟亚目、鳖科（trionychidae)。鳖科现有7属23种，我国仅有2属3种，其中鳖属有两个种，即中华鳖(chinesesoft-shelledturtle,pelodiscussinensis)和山瑞鳖（paleasteindachneri），其中以中华鳖最为常见。20世纪60年代日本开始进行中华鳖的人工养殖，我国的台湾、泰国等地随日本之后开始发展中华鳖的人工养殖，中国大陆大约于上世纪70年代中后期开始进行中华鳖工厂化人工养殖。随着我国人民生活水平的日益提高，对鳖的市场需求稳步增长，中华鳖养殖从90年代初期至中期进入了高速发展期。养殖技术也由集约化程度较低的池塘养殖转化为集约化程度较高的室内控温温室养殖，养殖密度大大提高。产量也从1993年的4427吨增长到1996年的32004吨，四年间增长了7倍。随后，我国中华鳖的养殖进入了平稳发展阶段。养殖模式逐渐发展为控温高密度室内养殖结合池塘高密度养殖、池塘鱼鳖混养、池塘鳖和其他水产养殖动物等仿生态养殖。

尽管中华鳖规模化养殖得到了迅猛发展，但品种退化、病害严重以及基础研究薄弱等问题严重影响中华鳖健康养殖的可持续发展。中华鳖病害防治是中华鳖养殖过程中的关键环节之一，它直接关系到养殖者的经济效益。范红结(2001)等从患病的中华鳖中分离到雷氏普罗威登菌，可引起中华鳖的败血症，并造成肺脏、脾脏等内脏广泛形成干酪样结节；孙红祥和舒妙安(2002)从从患“穿孔病”、“腐皮病”、“溶血性腹水病”等濒死鳖的肝、心血和腹水中分离到20株细菌；沈锦玉（2007)等从从患白底板病的中华鳖分离到嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌；li(2008)等从患“白斑病”的中华鳖中成功分离到淡紫拟青霉；张奇亚(1996)等首次从有典型症状、濒于死亡的患病病鳖样品检测到呈球形、大小直径约为30nm的病毒样粒子；chen(1999)等从患“红脖子”病的中华鳖分离到了直径120-160nm的鳖虹彩病毒；刘莉（2015）等从患“出血症”病的中华鳖中分离到了直径约100nm的rna病毒。然而，由于中华鳖生物学相关的基础研究工作相对滞后，加上养殖环境因子的复杂性，以及病原的多样性，导致很多病因只能归结于条件性致病，无法对引起中华鳖发病的致病机制进行判定，进而也无法采取有效的措施来进行防治。

鉴于此，本研究针对目前中华鳖产业中危害严重的“腮腺炎”病症，通过细菌学、病毒学的方法，结合养殖水环境的多种水质指标、菌群等因素的变化情况展开了系统性研究，初步确定了中华鳖细菌性“腮腺炎”的病因及其发病机制，确定一种腮腺炎病症的主要致病因子是一种芽孢杆菌，对中华鳖具有高致死性。针对这种代表性条件性致病菌-高致死性蜡样芽孢杆菌，建立一种快速诊断技术，满足对水体与养殖期中华鳖的检测需要，以期阻断病原的传播，对早期预防起到预警效应。

而lamp是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术（lamp）的原理，针对靶基因的特定区域设计特异性引物，利用一种具有链置换特性的dna聚合酶作用下进行恒温扩增，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。lamp产物的检测可以通过荧光染料观察的方法，具有安全、快捷、高效的特点，适合应用推广。目前，该技术在中华鳖细菌性腮腺炎的诊断中未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的lamp检测试剂盒，将环介导等温扩增技术与荧光染料相结合，能够快速便捷的检测中华鳖细菌性腮腺炎病原菌。

本发明还提供了一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的lamp检测引物。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的lamp检测试剂盒，包括特异性引物、反应缓冲液、bstdna聚合酶及荧光染料，所述特异性引物由外引物、内引物及环引物组成：

外引物：

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baclamp-b3:gcttcttttaatgttacatctggtt；

内引物：

baclamp-fip:tcttggatttgaggtaacacatcacttttattttgaaaatggaagagtgaggbaclamp-bip:cgcacgtatcatttttaatggggtttttttctagcggatcattaggatc；

环引物：

baclamp-lf:ccagttcgagcctgtatccac

baclamp-lr:tagagagacgtatagctgcgg。

本发明的引物中具有环引物，能够有效增加反应效率。

发明人在长期实践研究中筛选并确认了中华鳖细菌性腮腺炎病原-一种高致病性蜡样芽孢杆菌，并完成该细菌全基因组测序，在确定毒力基因的基础上，建立一种环介导恒温扩增技术来检测该致病菌，同时提供一种用于以上目的lamp恒温荧光法检测试剂盒。该试剂盒特异性强，灵敏度高，操作便捷，弥补现在中华鳖养殖过程中腮腺炎高发，而病原无法确认的现状，适合中华鳖细菌性腮腺炎病的筛查与预防。

本发明是根据扩增反应前后钙黄绿素（calcein）和锰离子的结合不同来展现颜色变化。在扩增反应结束后，检测管中反应液显示浅橙色表明反应结果为阴性，当检测管反应液显示绿色，表明反应结果为阳性。

本发明试剂盒的lamp核酸反应管中添加有核酸反应稳定液，核酸反应稳定液为矿物油。

进一步的，所述荧光染料为钙黄绿素。

进一步的，特异性引物、反应缓冲液、bstdna聚合酶及荧光染料组成的扩增反应液20μl中各组分组成如下：

1.6mmbaclamp-fip，1.6mmbaclamp-bip，0.2mmbaclamp-f3和baclamp-b3，0.2mmbaclamp-lf，0.2mmbaclamp-lr，20mmtris-hcl，10mm氯化钾，15mm硫酸铵，16mm硫酸镁，0.1%tritonx-100，0.6m甜菜碱，1.6mmdntp，8ubstdna聚合酶，1.25mm钙黄绿素，25mmmncl2。

进一步的，所述tris-hcl的ph为8.0～9.0。

一种检测中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的lamp扩增引物，所述lamp扩增引物由外引物、内引物及环引物组成：

外引物：

baclamp-f3:aggtatatgggaatatagcaaca

baclamp-b3:gcttcttttaatgttacatctggtt；

内引物：

baclamp-fip:tcttggatttgaggtaacacatcacttttattttgaaaatggaagagtgaggbaclamp-bip:cgcacgtatcatttttaatggggtttttttctagcggatcattaggatc；

环引物：

baclamp-lf:ccagttcgagcctgtatccac

baclamp-lr:tagagagacgtatagctgcgg。

本发明的有益效果是：

1、本发明所采用特异性引物是根据蜡样芽孢杆菌毒力基因（毒力基因序列见seqidno.7）的六个不同区域设计的，特异性比仅有一对引物的常规pcr强；

2、本发明的检测试剂盒检测灵敏度高，是常规pcr的10倍；

3、本发明的检测试剂盒检测时间短，可以在90min左右获得检测结果，比常规pcr节约3～4小时；

4、本发明的检测试剂盒对仪器设备要求低，不需要昂贵的pcr仪、凝胶电泳和成像系统，仅需要恒温水浴锅与便携式离心机即可；

5、本发明的检测试剂盒操作简单，结果直观易判定，易于推广应用；

6、本发明的检测试剂盒对人和环境较安全，整个过程不使用有毒物质。

附图说明

图1为扩增温度对lamp反应的影响图。m：dl2000dnamarker(takara公司)；泳道1：60℃恒温条件下扩增结果；泳道2：61℃恒温条件下扩增结果；泳道3：62℃恒温条件下扩增结果；泳道4：63℃恒温条件下扩增结果；泳道5:64℃恒温条件下扩增结果；泳道6：65℃恒温条件下扩增结果；

图2为b.cereus-lamp特异性实验结果图。m：dl2000dnamarker(takara公司)；泳道1：中华鳖蜡样芽孢杆菌（b.cereus）；泳道2：中华鳖嗜水气单胞菌；泳道3：中华鳖温和气单胞菌；泳道4：中华鳖迟缓爱德华氏菌；泳道5：阴性对照。

图3为b.cereus-lamp灵敏度实验结果图。m：dl2000dnamarker(takara公司)；泳道1～5：模板分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5倍稀释的基因组dna。

图4为pcr方法的灵敏度实验结果图。m：dl2000dnamarker(takara公司)；泳道1～5：模板分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5倍稀释的基因组dna。

图5为lamp技术检测感染中华鳖源蜡样芽孢杆菌样品实验结果图。m：dl2000dnamarker(takara公司)；左侧检测管：为阳性样品检测结果（显示绿色）；右侧检测管：为阴性对照样品检测结果（显示浅橙色）。

图6为扩增时间对lamp反应的影响图。m：dl2000dnamarker(takara公司)；泳道1：15min扩增结果；泳道2：30min扩增结果；泳道3：45min扩增结果；4：60min扩增结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

1、材料

感染致病性蜡样芽孢杆菌的中华鳖采集自浙江省杭州市萧山区某养殖场；所用引物由上海生工生物公司合成；bstdna聚合酶大片段购自newenglandbipolabs公司；dntp购自promega公司；钙黄绿素、氯化锰、甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司。

2、感染病菌中华鳖样品dna的提取：

（1）以无菌采样袋采集500ml中华鳖养殖塘水，用0.45μm过滤膜过滤后将膜研磨碎，加入100～200μl无菌蒸馏水后在沸水中煮10min，5000rpm离心1min，取上清备用；

（2）取25～50mg的中华鳖肝、脾或肺组织，加入50～200μl组织裂解液匀浆混匀，所述组织裂解液包括:30～50mm、ph7.4tris-hcl，4～6m的异硫氰酸胍，10～15mmedta；向其中加入20～30μl蛋白酶k溶液（20mg/ml），立刻振荡混匀，然后置于56℃水浴1小时直到组织彻底消化；将消化液转移到带有玻璃纤维素膜的吸附柱ac中，吸附柱置于收集管中，12000rpm离心1min；用漂洗液和去蛋白液洗涤上述吸附柱，所述去蛋白液组成为：20～40mm、ph7.4的tris-hcl，0.2～0.6m异硫氰酸胍和20～50%无水乙醇；所述漂洗液组成为：20～50mm、ph7.4的tris-hcl，60～120mmnacl和75%的无水乙醇；利用灭菌过的双蒸水洗脱所述吸附柱上吸附的dna。

以上dna提取液可置于-20℃保存备用。

3、中华鳖细菌性腮腺炎病原-lamp恒温扩增：

（1）根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测反应液（含阳性对照、阴性对照，其中阳性对照样品为中华鳖源高致病性蜡样芽孢杆菌基因组dna片段，阴性对照样品为无核酸的rnasefreewater），核酸检测反应液组成为：1.6mmbaclamp-fip，1.6mmbaclamp-bip，0.2mmbaclamp-f3和baclamp-b3，0.2mmbaclamp-lf，0.2mmbaclamp-lr，20mmtris-hcl（ph8.0～9.0），10mm氯化钾，15mm硫酸铵，16mm硫酸镁，0.1%tritonx-100，0.6m甜菜碱，1.6mmdntp，8ubstdna聚合酶，1.25mm钙黄绿素，25mmmncl2，每管检测预反应液体积为20μl；

外引物序列如下：

baclamp-f3:aggtatatgggaatatagcaaca（seqidno.1）

baclamp-b3:gcttcttttaatgttacatctggtt（seqidno.2）；

内引物序列如下：

baclamp-fip:tcttggatttgaggtaacacatcacttttattttgaaaatggaagagtgagg（seqidno.3）

baclamp-bip:cgcacgtatcatttttaatggggtttttttctagcggatcattaggatc（seqidno.4）；

环引物序列如下：

baclamp-lf:ccagttcgagcctgtatccac（seqidno.5）

baclamp-lr:tagagagacgtatagctgcgg（seqidno.6）。

（2）分别吸取5μl不同浓度的待检样品dna加入核酸检测反应管中，混合均匀；

（3）标记清楚后，将检测反应管置于61℃水浴锅中，反应45min；

4、pcr扩增：

（1）根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测反应液：2×pcrmastermix12.5µl,10µm引物（baclamp-f3/r3）各0.25µl，模板5µl，用双蒸水补足至25µl。扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环后72℃7min。

（2）将pcr扩增产物置于4℃保存。

5、b.cereuslamp扩增产物进行凝胶电泳：

（1）配置1.5%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入8μl的反应产物；

（2）电泳30分钟后凝胶成像，b.cereus-lamp结果见图2和图3，b.cereus-pcr结果见图4。

6、b.cereus-lamp荧光染料法检测，肉眼观察结果如图5所示。

利用本发明所述的检测试剂盒和检测方法检测一种中华鳖细菌性腮腺炎病原-蜡样芽孢杆菌（b.cereus），经过凝胶电泳，由图1、2、3可见阶梯状的扩增条带；图2特异性实验结果和图3灵敏度检测结果表明本检测方法具有较好的特异性和灵敏度；图6表明b.cereus-lamp检测用时较短，远低于pcr方法；利用荧光染料展示反应结果，图5结果表明色差对比度高，易于分辨。

根据以上实验结果表明，本发明的检测试剂盒和检测方法可以为中华鳖细菌性腮腺炎提供快速、简便、灵敏的检测。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110>浙江省淡水水产研究所

<120>一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的lamp检测试剂盒及检测引物

<130>2017.11

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

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<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

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<210>3

<211>52

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<213>人工序列()

<400>3

tcttggatttgaggtaacacatcacttttattttgaaaatggaagagtgagg52

<210>4

<211>49

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<211>21

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<213>人工序列()

<400>5

ccagttcgagcctgtatccac21

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>6

tagagagacgtatagctgcgg21

<210>7

<211>2301

<212>dna

<213>蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)

<400>7

atgtatatgaaaaaaagaaaagcgttaataccattaatggcattgtctacgatattagtt60

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