本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记及其应用。
背景技术：
烟草黑胫病是由烟草疫霉（phytophtoraparasiticavar．nicotianaetucker）引起的土传性真菌病害，其可侵染所有的栽培烟草，是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，中国于1950年在黄淮烟区首次报道（尚志强.烟草黑胫病病原、发生规律及综合防治研究进展.中国农业科技导报,2007,9(2):73-76.）。目前已鉴定出的烟草黑胫病生理小种有4个：0号和1号生理小种于1962年在美国北卡罗来纳州发现（applejl.physiologicalspecializationwithinphytophthoranicotianaevar.nicotianae.phytopathology,1962,52:351-354；applejl.occurrenceofrace1ofphytophthoraparasiticavar.nicotianaeinnorthcarolinaanditsimplicationsinbreedingfordiseaseresistance.tob.sci.,1967,11:79-83.）；2号生理小种于1973年在南非被鉴定（lamprechtmp.breedingflue-curedtobaccoresistanttosouthafricanblackshank(phytophthoranicotianae(b.dehaan)var.nicotianae).agroplantae,1973,5:67-72.）；3号生理小种于1978年在美国康涅狄格州被发现（mcintyrejl,andtaylorgs.race3ofphytophthoraparasiticavar.nicotianae.phytopathol,1978,68:35-38.）。在中国，烟草黑胫病菌至少有0号和1号两个生理小种，当前以0号小种为优势小种，但局部烟区1号小种有转变为优势小种的趋势（朱贤朝,郭振业,刘保安,等.我国烟草黑胫病菌生理小种研究初报.中国烟草,1987(4):1-3；王智发,刘延荣,谢成颂,等.我国烟草黑胫病菌生理小种鉴定.山东农业大学学报,1987,18(1):l-8.）。
受益于生物全基因组高通量测序技术的发展与大量烟草基因组数据的公布（sierron,vanoeverenj,vaneijkmj,martinf,stormoke,peitschmc,ivanovnv.wholegenomeprofilingphysicalmapandancestralannotationoftobaccohicksbroadleaf.plantj,2013,75(5):880-889；sierron,batteyjn,ouadis,bakahern,bovetl,williga,goepferts,peitschmc,ivanovnv.thetobaccogenomesequenceanditscomparisonwiththoseoftomatoandpotato.natcommun,2014,5:3833.doi:10.1038/ncomms4833.），以及大规模烟草ssr标记的开发和高质量烟草遗传连锁图谱的构建（bindlerg,plieskej,bakahern,gunduzi,ivanovn,vanderhoevenr,ganalm,doninip.ahighdensitygeneticmapoftobacco(nicotianatabacuml.)obtainedfromlargescalemicrosatellitemarkerdevelopment.theorapplgenet,2011,123(2):219-230；tongzj,xiaobg,jiaofc,fangdh,zengjm,wuxf,chenxj,yangjk,liyp.large-scaledevelopmentofssrmarkersintobaccoandconstructionofalinkagemapinflue-curedtobacco.breedingscience,2016,66:381-390.），使国内外研究者在分子水平上对烟草黑胫病的研究有了很大进展。烟草黑胫病0号生理小种不仅广泛存在于世界各大烟区，而且是优势小种，因此对其研究较早且深入，主要集中在利用源于烟草野生种nicotianaplumbaginifolia和nicotianalongiflora的抗病基因培育高抗烟草黑胫病0号生理小种的烟草新品种或品系（johnsoncs,wernsmanea,andlamondiaja.effectofachromosomesegmentmarkedbythephpgeneforresistancetophytophthoranicotianaeonreproductionoftobaccocystnematodes.plantdis.,2009,93:309-315；johnsones,wolffmf,wernsmanea,andruftyrc.marker-assistedselectionforresistancetoblackshankdiseaseintobacco.plantdis.,2002,86:1303-1309.），同时，将与烟草黑胫病0号生理小种抗性基因ph紧密连锁的标记及其应用申请了专利（cn103993013b；cn105506148a）。
随着对烟草黑胫病0号小种研究的深入及相关抗病品种的培育，使得局部烟区烟草黑胫病1号生理小种有取代0号生理小种成为优势小种的趋势，因此，培育同时具有黑胫病0号、1号生理小种抗性的烟草品种（品系）成为目前克服烟草黑胫病、保持持久抗性的最经济、有效途径。目前止，同时具有黑胫病0号、1号生理小种抗性的烟草品种主要是属于雪茄烟的florida301和beinhart1000-1两个，且其黑胫病抗性是受微效多基因和环境因素共同控制的数量性状（xiaobg,drakek,vontimittav,tongzj,zhangxt,limy,lengxd,liyp,lewisrs.locationofgenomicregionscontributingtophytophthoranicotianaeresistanceintobaccocultivarflorida301.cropsci,2013,53:473-481；vontimittavandlewisrs.growthchamberevaluationofatobacco‘beinhart1000’בhicks’mappingpopulationforquantitativetraitlociaffectingresistancetomultipleracesofphytophthoranicotianae.cropsci,2012,52:91-98；vontimittavandlewisrs.mappingofquantitativetraitlociaffectingresistancetophytophthoranicotianaeintobacco(nicotianatabacuml.)linebeinhart-1000.molbreeding,2012,29:89-98.）。最近，drake等（drakek,andlewisrs.anintrogressednicotianarusticagenomicregionconfersresistancetophytophthoranicotianaeincultivatedtobacco.cropsci.2013,53:1366-1374；drakeke,moorejm,bertrandp,fortnumb,petersonp,andlewisrs.blackshankresistanceandagronomicperformanceofflue-curedtobaccolinesandhybridscarryingtheintrogressednicotianarusticaregion,wz.cropsci.2015,55:79-86.）报道了一种来源于黄花烟草（nicotianarustia）中同时具有黑胫病0号、1号生理小种抗性的新抗源，被命名为wz基因片段，该抗源所控制的黑胫病抗性与上述两个雪茄烟品种一样，都属于受微效多基因和环境因素共同起作用的数量性状。上述具有黑胫病0号、1号抗性的烟草种质均具有以下不足之处：1）属于数量性状，抗性中等且不易将抗性qtl进一步用于育种。2）控制黑胫病抗性的qtl与不利性状存在连锁累赘，对雪茄烟florida301和beinhart1000-1而言，在将抗性qtl向烤烟进行转移时，会因烤烟中带有部分雪茄烟的基因组片段而难以保持烤烟自身优良的品质。鉴于此，寻找一种抗烟草黑胫病0号和1号生理小种的质量性状基因（核酸片段）并开发一种能解决上述问题的方法是非常必要的。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记；第二目的在于提供所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记的编号为tm51207和tm55805，其扩增产物核苷酸序列分别为seqidno.1和seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记在检测烟草基因组dna中是否存在抗烟草黑胫病0号、1号生理小种基因bs_t中的应用。
为了简便、高效选择抗黑胫病0号、1号生理小种的烟草品种，有针对性的、特异性的选择含bs_t基因的后代材料，本发明提供一种用于检测烟草抗黑胫病0号、1号生理小种基因bs_t的分子标记tm51207和tm55805，该分子标记采用分离群体分组分析（bulkedsegregationanalysis,bsa）法，筛选获得与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记，可以用于烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及抗病品种选育的效率。
本发明利用gh14-62（抗病亲本材料，其黑胫病0号、1号生理小种抗性由黄花烟草n.rustica基因组的核苷酸片段（基因）bs_t控制）和红花大金元（具有优良品质但易感黑胫病0号、1号生理小种）构建自交二代（f2）分离群体，采用分离群体分组分析（bulkedsegregationanalysis,bsa）法，筛选与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记，加速分子标记辅助选择（markerassistantselection，mas）在烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性品种选育中的利用。
本发明所述的ssr标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草黑胫病0号、1号生理小种抗病育种中bs_t基因分子标记辅助选择的应用。
附图说明
图1是ssr标记tm51207和tm55805分别与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t的连锁关系；
其中，左侧为标记（基因）名称；右侧为标记与bs_t基因间的遗传距离（单位为：cm）；
图2是与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记在5份材料中的pcr扩增产物凝胶电泳图；
其中，a，ssr标记tm55805；b，ssr标记tm51207；f1，两亲本间的杂交子一代；rp，抗病亲本材料（gh14-62）；sp，感病亲本（红花大金元）；rb，抗病池；sb，感病池；m，100bpdnaladder，长度片段分别为：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp；
图3是ssr标记tm51207在23个（300个f2单株中部分材料）f2单株中的pcr扩增产物凝胶电泳图；
其中，编号18（带黑色星星）为单交换单株；1-20为f2单株编号；编号1-10，田间表型鉴定为感病单株的编号；编号11-20，田间表型鉴定为抗病单株编号；sp，感病亲本红花大金元；rp，抗病亲本材料gh14-62；f1，杂交子一代；
图4是ssr标记tm55805在23个（300个f2单株中部分材料）f2单株中的pcr扩增产物凝胶电泳图；
其中，编号14和19（带黑色星星）为单交换单株；1-20为f2单株编号；编号1-10，田间表型鉴定为感病单株编号；编号11-20，田间表型鉴定为抗病单株编号；sp，感病亲本红花大金元；rp，抗病亲本材料gh14-62；f1，杂交子一代。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记的编号为tm51207和tm55805，其扩增产物核苷酸序列分别为seqidno.1和seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。
所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
tm51207序列为tm51207f：5’-aaacgctcccaaatcttcaa-3’，
tm51207r：5’-ggcaaaatccttactagttcacg-3’；
tm55805序列为tm55805f：5’-gaactgggaagctcaccaaa-3’，
tm55805r：5’-cctctcttgcccctttctct-3’。
本发明所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记的应用为所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记在检测烟草基因组dna中是否存在抗烟草黑胫病0号、1号生理小种基因bs_t中的应用。
本发明所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记的应用，是分别以tm51207序列的引物和tm55805序列的引物分别扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物，如果pcr扩增产物中分别含有如seqidno.1和seqidno.2所示序列即为含有抗烟草黑胫病0号、1号生理小种的纯合基因型bs_tbs_t；如果pcr扩增产物中分别含有如seqidno.3和seqidno.4所示序列即为不含有抗烟草黑胫病0号、1号生理小种的纯合基因型bs_tbs_t，而含有其感病的纯合等位基因型bs_tbs_t；如果pcr扩增产物中含有如seqidno.1和seqidno.2所示序列，同时含有如seqidno.3和seqidno.4所示序列即为含有烟草抗黑胫病0号、1号生理小种的杂合基因型bs_tbs_t。
所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记的应用，以tm51207序列的引物进行pcr扩增的反应体系为50ul，其中包含5.0μl的1×buffer（10mmtris-cl,ph=8.4,50mmkcl,1.5mmmgcl2），500μm的dntps（takarabiotechnologyco.ltd.,dalian,china），2.0μm的上下游引物（takara），2.5u的rtaq聚合酶（takara），30-100ng模板dna，最后用ddh2o补齐50ul。
所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记的应用，以tm51207序列的引物进行pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，60℃复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。
所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记的应用，以tm55805序列的引物进行pcr扩增的反应体系为50ul，其中包含5.0μl的1×buffer（10mmtris-cl,ph=8.4,50mmkcl,1.5mmmgcl2），500μm的dntps（takarabiotechnologyco.ltd.,dalian,china），2.0μm的上下游引物（takara），2.5u的rtaq聚合酶（takara），30-100ng模板dna，最后用ddh2o补齐50ul。
所述的与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记的应用，以tm55805序列的引物进行pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，60℃复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
利用分离群体分组分析（bsa）法，筛选与烟草抗黑胫病0号、1号生理小种bs_t基因连锁的ssr标记
一、实验材料
以品质优良但易感烟草黑胫病0号、1号生理小种的烤烟红花大金元为母本，以抗黑胫病0号、1号生理小种烤烟育种材料gh14-62（其黑胫病0号、1号生理小种的抗性由bs_t基因（核酸片段）控制，且通过种间远缘杂交方式将黄花烟草（n.rustica）抗黑胫病0号、1号生理小种的基因组片段转移到烤烟红花大金元中而形成的）为父本，杂交、自交，分别获得f1和f2群体。
二、亲本及f2分离群体黑胫病0、1号生理小种抗性鉴定
试验材料成苗后移栽至大田，行株距为100cm×50cm；移栽3周后进行人工接种。接种时将两亲本及其f1平均分成两份，每份30个单株，然后利用事先培养获得的烟草黑胫病0号和1号生理小种分别对每份材料进行接种。对于f2分离群体，则采用组培扩繁法，即，利用组织培养方法将300个f2单株进行扩大繁殖，使每一f2单株经组培扩繁后形成含有10个相同基因型的f2株系，并将每个f2株系分成两份，每份5个单株，然后分别接种0号、1号生理小种。
三、ssr标记分析
在烟草幼苗期，采用改良的ctab法（tongzj,etal.large-scaledevelopmentofmicrosatellitemarkersinnicotianatabacumandconstructionofageneticmapofflue-curedtobacco.plantbreeding,2012,131:674-680）提取所有参试材料的全基因组dna。
ssr-pcr的体系配制、产物扩增及扩增产物的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（6%-non-page）检测，参照童治军等（童治军等.普通烟草及其祖先种基因组ssr位点分析.中国农业科学,2015,48(11):2108-2117）提供的方法进行。ssr标记（引物）由两部分构成，共18764对，其中，pt系列引物5119对（bindler,etal.ahighdensitygeneticmapoftobacco(nicotianatabacuml.)obtainedfromlargescalemicrosatellitemarkerdevelopment.theor.appl.genet.,2011,123(2):219-230），tm系列引物13645对（tongzj,etal.large-scaledevelopmentofmicrosatellitemarkersinnicotianatabacumandconstructionofageneticmapofflue-curedtobacco.plantbreeding,2012,131:674-680；tongzj,etal.large-scaledevelopmentofssrmarkersintobaccoandconstructionofalinkagemapinflue-curedtobacco.breedingscience,2016,66:381-390）。
四、抗、感病基因组池的构建
采用分离群体分组分析法（bsa），选取f2分离群体中的极端抗病单株（正常存活）和极端感病（后期死亡）单株各15株的基因组dna，等量混合构建抗、感池，用于引物多态性筛选和标记连锁分析。
在苗期按实施例1所述方法，利用18764对ssr引物对抗病亲本材料gh14-62、感病亲本红花大金元、两亲本间杂交子一代（f1）、抗病池和感病池共5份材料进行pcr扩增，筛选与抗烟草黑胫病0号、1号生理小种基因bs_t连锁的ssr标记。筛选的结果如图2所示：ssr标记tm512027和tm55805分别与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁，标记tm51207和tm55805在感病池与感病亲本中的带型完全一致，仅出现一条186bp（序列如seqidno.3）和164bp（序列如seqidno.4）的特异性条带；在抗病池与f1中的带型完全一致，呈现出共显性的两条特异性条带（同时具有抗、感亲本的特异性条带，也即，同时呈现如seqidno.1和seqidno.3所示序列及如seqidno.2和seqidno.4所示序列）。其中，seqidno.1和seqidno.2所示序列长度分别为132bp和176bp，分别是共显性ssr标记tm51207和tm55805在含有bs_t基因的抗黑胫病0号、1号生理小种品种中的特异性pcr扩增条带。
以上结果表明，标记tm51207和tm55805分别与烟草抗黑胫病0号、1号生理小种基因bs_t连锁，且该标记为共显性标记。pcr扩增产物中分别含有如seqidno.1（132bp）和seqidno.2（176bp）所示序列即为含有烟草抗黑胫病0号、1号生理小种的纯合基因bs_tbs_t；pcr扩增产物中分别含有如idno.3（186bp）和seqidno.4（164bp）所示序列即含有其感病的纯合等位基因bs_tbs_t；pcr扩增产物中同时含有如seqidno.1和seqidno.3或同时含有seqidno.2和seqidno.4所示序列即含有烟草抗黑胫病0号、1号生理小种的杂合基因bs_tbs_t。
实施例2
连锁标记的图距及其在f2群体单株中的验证
一、数据分析
首先，按实施例1所述方法进行烟草基因组dna提取，f2群体组培扩繁单株黑胫病0号、1号生理小种抗性鉴定和ssr标记分析。其次，利用通过bsa法筛选获得的标记tm51207和tm55805对f2群体中的300个单株进行基因型分析。最后，对各个单株的带型进行数据统计，抗病纯合条带标记记作“b”，抗病杂合条带标记作“h”，感病条带标记作“a”，条带不清晰或者无扩增条带的记做“u”。
二、连锁标记遗传距离的计算
利用joinmap4.0软件并结合f2群体单株的黑胫病0号、1号生理小种抗性鉴定数据，对ssr标记在f2分离群体中的基因型数据进行遗传连锁分析，计算出其连锁距离并绘制连锁图。
f2群体单株黑胫病0号、1号生理小种抗性鉴定的结果为：300个单株中，感病单株有81个，抗病单株有219个，符合显性单基因控制的抗感表型比为3:1的比例。
以seqidno.5和seqidno.6为引物，对300株f2单株基因组dna进行pcr扩增，其部分扩增结果如图3所示：前10个单株（编号为1-10）仅含有长度为186bp的条带，其序列如seqidno.3所示，即该10个单株感黑胫病0、1号生理小种，且基因型为bs_tbs_t；后10个单株（编号为11-20）中除一个单株（编号为18）外，有1个单株（编号16）中含有132bp条带，其序列如seqidno.3所示，即该单株中因含有如seqidno.1所示的序列（132bp）而抗黑胫病0号、1号生理小种，且为纯合基因型bs_tbs_t；其余8个单株中同时含有132bp和186bp两条带，其序列分别如seqidno.1和seqidno.3所示，即该8个单株中因含有如seqidno.1所示的序列（132bp）而抗黑胫病0号、1号生理小种，且为杂合基因型bs_tbs_t。
以seqidno.7和seqidno.8为引物，对300株f2单株基因组dna进行pcr扩增，其部分扩增结果如图4所示：前10个单株（编号为1-10）仅含有长度为164bp的条带，其序列如seqidno.4所示，即该10个单株感黑胫病0、1生理小种，且基因型为bs_tbs_t；后10个单株（编号为11-20）中除两个单株（编号为14和19）外，其余8个单株中仅含有176bp条带，其序列如seqidno.2所示，即该8个单株中因含有如seqidno.2所示的序列（176bp）而抗黑胫病0号、1号生理小种，且为纯合基因型bs_tbs_t。
由上述两个连锁标记对300个f2单株的基因型分析可知：两个标记中分别有8个和10个单株呈现出单交换，即抗性鉴定的结果为抗性单株，而基因型分析的结果却为感病（仅出现感病基因型的特异条带）。因此，利用joinmap4.0作图软件计算可知，该两个共显性标记tm51207和tm55805与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁且位于bs_t基因的两侧，其各自与bs_t基因间的遗传距离分别约为1.334cm和1.679cm，如图1所示。
结论：利用上述两个ssr标记既可简便、快捷、稳定地检测烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t存在，又可清晰地鉴定出抗黑胫病0号、1号生理小种纯合基因型bs_tbs_t、抗病杂合基因型bs_tbs_t及感病纯合基因型bs_tbs_t，也可有针对性的、特异性的选择含bs_t基因的后代材料并大大提高选择抗黑胫病0号、1号生理小种烟草品种的效率。
sequencelisting
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>一种与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因bs_t连锁的ssr标记及其应用
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