本发明涉及生物
技术领域：
：，具体地说是小麦根系相关性状的snp分子标记及应用。
背景技术：
：：小麦是世界上最重要的粮食作物之一，由于耕地减少与人口数量增长，提高产量与抗逆境胁迫能力成为小麦育种重要目标。根系作为植物地下器官，在植物生长发育中发挥着重要作用。根系各项形态特征与根吸收、同化、转运等生理特性密切相关，从而影响着作物的产量、品质和抗性(inukai等，2011；grossman和rice，2012)。ehdaie等(2010)证实了根系生物量与氮、磷、钾等多种营养元素的摄取显著正相关。根系密度与土壤中无机物的吸收也显著相关,根系密度越大,土壤中无机物流失越少,在土壤水分缺失的情况下尤为明显(gonzalez-dugo，2010)。根毛增加了根系吸收水分与营养物质的表面积，同时也是植物与土壤微生物互作的位点(wasson等，2012)。根系角度影响根系在土层中的分布，也影响着植株对较深土层中水分的吸收(christopher等，2010；lynch，2013；chimungu等，2014)。根系能够响应各种生物与非生物胁迫，通过信号转导途径影响地上部分的生长。水稻根系的根长、直径、干重、总吸收面积与水稻产量正相关(liu，2014)。根系性状由多微效基因控制，是一种可遗传变异，且较容易受到环境条件影响，其遗传机制的研究较为困难。根系性状基因的发现主要是依据相关突变体的创制(geldner等，2003)以及qtl定位。由于利用理化诱变创制相应突变体具有随机性，较难获得目的突变体。传统qtl定位由于分子标记与定位群体大小的影响，定位精度小，不利于基因的精细定位。因此，开发新的小麦根系相关性状的分子标记，对于促进小麦生长发育分子机制的研究，使小麦获得更高产量与较强抗逆境胁迫能力的根系表型，对于小麦的品种改良具有重要意义。技术实现要素：本发明以黄淮麦区及国外引进的166份小麦品种(系)为试验材料，利用覆盖全基因组的snps标记对其进行遗传多样性分析，发掘与根系生长发育相关的qtl位点。本发明的技术任务是按以下方式实现的，本发明的目的是提供小麦根系相关性状的snp分子标记，通过对小麦的根系性状进行全基因组关联分析获得小麦根系相关性状的snp分子标记，所述的snp分子标记包括4个snp分子标记，snp1、snp2、snp3、snp4；所述的snp1的核苷酸序列为seqidno.1,该snp位点为seqidno.1中自5’末端起第51位核苷酸，上述序列的第51bp位核苷酸为a或c，导致多态性,seqidno.1所示dna片段在小麦1b染色体上第61cm位置；所述的snp2的核苷酸序列为seqidno.2,该snp位点为seqidno.2中自5’末端起第101位核苷酸，上述序列的第101bp位核苷酸为a或g，导致多态性,seqidno.2所示dna片段在小麦3a染色体上第177cm位置；所述的snp3的核苷酸序列为seqidno.3,该snp位点为seqidno.3中自5’末端起第51位核苷酸，上述序列的第51bp位核苷酸为a或g，导致多态性,seqidno.3所示dna片段在小麦2d染色体上第80cm位置；所述的snp4的核苷酸序列为seqidno.4,该snp位点为seqidno.4中自5’末端起第47位核苷酸，上述序列的第47bp位核苷酸为a或g，导致多态性,seqidno.3所示dna片段在小麦2b染色体上第157cm位置。进一步，优选的，所述的snp1、snp2、snp3和snp4与小麦根系的根系平均直径相关联。进一步，优选的，将所述的snp1分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，所述的序列blast到的候选基因编码具iq基序的钙调素结合蛋白；将所述的snp2分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，所述的序列blast到的候选基因编码泛素连接酶e3；将所述的snp3分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，所述的序列blast到的候选基因编码cullin-3a蛋白；将所述的snp4分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，所述的序列blast到的候选基因编码arfgap。一种筛选大直径根系小麦的方法，检测待测小麦的染色体2d上的80cm位置是否含有snp3位点，并且检测该位点的基因型；若第51bp位核苷酸为a的基因型，则判定所述的待测小麦为大直径根系；所述的snp3的核苷酸序列为seqidno.3,该snp位点为seqidno.3中自5’末端起第51位核苷酸，上述序列的第51bp位核苷酸为a或g，导致多态性,seqidno.3所示dna片段在小麦2d染色体上第80cm位置。植物根系性状相关的基因分析方法，具体步骤包括：s1、选用植物品种，将植物品种材料分别在水培条件和/或大田环境下进行培养；s2、利用扫描仪扫描根系，获取各单株植物根系图片；对获取的各单株植物根系图片进行分析，获得各样品的根系性状数值；s3、利用ctab法提取植物基因组dna，对供试材料进行基因分型并筛选，得到snp分子标记；s4、对植物品种进行群体结构分析与亲缘关系分析；s5、利用群体结构分析结果、亲缘关系分析结果与筛选到的snp分子标记进行根系性状的全基因组关联分析，从中选取与根系性状关联的snp分子标记；s6、将与根系性状关联的snp分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，获得与根系性状相关的候选基因；s7、将获得的候选基因进行基因功能分析，筛选出功能与根系性状相关的候选基因，进一步确定与根系性状关联的snp分子标记。进一步，优选的方法为，所述的植物为小麦，所述的根系性状为根系总长度、根系表面积、根系平均直径、根系体积和根尖数。进一步，优选的方法为，所述的全基因组关联分析结果包括：大田环境下，检测到10个与根系性状显著关联的标记，其中，与根系总长度显著关联的标记有2个，分布在3a和5b染色体上，并分别解释8.6％和9.8％的表型变异；与根系表面积显著关联的标记有3个，分布在3a和5b染色体上，并分别解释8.49％、10.27％和9.86％的表型变异；与根系平均直径显著关联的标记有2个，分布在2d和7a染色体上，并分别解释9.7％和9.44％的表型变异；与根系体积显著关联的标记有4个，分布在3a、5a、7a和2b染色体上，并分别解释9.62％、9.91％、9.88％和10.31％的表型变异；与根尖数显著关联的标记2个，分布在7a和5b染色体上，并分别解释9.89％和9.27％的表型变异；其中，3a染色体上的标记wsnp_ex_rep_c104884_89459472，与根系总长度、根系表面积和根系体积均显著相关，5b染色体上的标记tdurum_contig47576_291与根系总长度和根系表面积均显著相关。进一步，优选的方法为，所述的全基因组关联分析结果包括：水培环境下，检测到15个与根系性状显著关联的标记，其中，与根系总长度显著关联的标记有3个，分布在6a、2d和4b染色体上，并分别解释10.32％、11.84％和10.37％的表型变异；与根系表面积显著关联的标记有3个，分布在6a、5b和4b染色体上，并分别解释10.86％、10.5％和10.49％的表型变异；与根系平均直径显著关联的标记有6个，分布在1b、2b、3b、2a、7a和3a染色体上，并分别解释23.86％、16.95％、8.4％、31.3％、30.66％和30.66％的表型变异；与根系体积显著关联的标记有5个，分布在6a、7a、2b、2a和4b染色体上，并分别解释10.14％、12.59％、11.05％、11.09％和10.47％的表型变异；与根尖数显著关联的标记2个，分布在2a和1a染色体上，并分别解释13.37％和11.05％的表型变异；6a染色体上的标记bs00062781_51，4b染色体上的标记wsnp_ra_rep_c69724_67278233与根系总长度、根系表面积和根系体积均显著相关。进一步的,所述的小麦品种为166份，包括：安1331，阜936，淮麦18，淮麦20，淮麦21，皖23094，皖麦19，皖29，皖麦33，皖麦38，皖麦50，皖麦52，皖麦53，宿0663，宿农6号；高优503，藁城8901，观35，邯6172，衡7228，衡观33，冀师02-1，金禾9123，石4185，石家庄15，石家庄8号，石新733，石新828，石优17，11ca40，85中33，矮抗58，百农3217，百农64，花培5号，兰考，24，兰考2号，兰考906，洛旱2号，洛麦21，内乡188，内乡5号，新麦19，新麦9408，新麦9号，偃展4110，豫麦13，豫麦18，豫麦21，豫麦2号，豫麦34，豫麦35，豫麦47，豫麦49，豫麦50，豫麦57，豫麦63，豫麦7号，郑9023，郑麦366，郑引1号，郑州3号，中892，中麦871，中麦875，中麦895，中育5号，中育9号，周8425b，周麦11，周麦12，周麦13，周麦16，周麦18，周麦19，周麦22，周麦23，周麦25，周麦26，周麦28，周麦30，周麦31，周麦32，ph82-2，济麦19，济麦20，济麦21，济麦22，济南13，济南17，济宁16，良星66，良星99，临麦2号，临麦4号，鲁麦11，鲁麦14，鲁麦15，鲁麦21，鲁麦23，鲁麦5号，鲁麦6号，鲁麦7号，鲁麦8号，鲁麦9号，鲁原502，山农20，泰山1号，泰山5号，汶农14，汶农5号，烟农15，烟农18，烟农19，淄麦12，淄选2号，晋麦61，临旱2号，临抗12，矮丰3号，碧蚂1号，碧蚂4号，丰产3号，陕150，陕229，陕253，陕354，陕512，陕715，陕麦509，陕麦94，陕农78-59，陕农981，陕优225，武农148，西农1376，西农2000-7，西农291，西农88，西农979-005，小偃22，小偃54，小偃6号，小偃81，aca601，aca801，kleinflecha，kleinjabal1，niderabaguette10，niderabaguette20，prointacolibr1，sunstate，kanto107，kitanokaori，norin61，norin67，abbondanza，barra，dorico，funo，genio，lampo，libero，hk1/6/nvsr3/5/bez/tvr/5/cfn/bez//su92/ci13645/3nai60，mantol，sagittario。snp分子标记snp4在筛选大直径根系小麦中的应用。本发明的小麦根系相关性状的snp分子标记及应用和现有技术相比，利用覆盖全基因组的snp分子标记对其进行遗传多样性分析，发掘与根系生长发育相关的qtl位点，寻找与根系性状相关联的优异等位变异，将极大的提高育种工作中对根系性状优良基因型选择的准确性和预见性，有利于促进小麦生长发育分子机制的研究，对于小麦的品种改良具有重要意义。附图说明附图1为群体结构分析当k取2～7时δk的变化趋势图；附图2为166份小麦材料的群体结构图；附图3为kasp检测结果图。具体实施方式实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所有引物的合成均由北京奥科生物技术有限责任公司完成，以下实施例中所用的小麦材料均来自中国农业科学院作物科学研究所。应用全基因组关联分析(genomewideassociationstudy，gwas)定位qtl比传统定位方法更精确。该方法是以连锁不平衡为基础，在全基因组范围内筛选出控制目标性状表型变异的功能基因或功能位点。随着高通量测序技术的发展，遗传统计方法的不断完善，gwas技术已日渐成为解析生物体复杂遗传结构的重要手段。在农业生产中，gwas技术也为作物农艺、产量、品质和抗性等复杂性状的研究提供了有效途径(唐富福等，2013)。实施例1：一、试验材料培养试验材料为166份黄淮麦区及国外小麦主栽品种及高代品系(表1)，表1供试小麦材料table1wheatvarieties/linesusedinthisstudy1、水培试验分别在166份材料中挑选大小一致小麦种子，10％h2o2浸泡10min，去离子水冲洗三次后，置于湿润滤纸上，培养至两叶一心。选取长势一致的幼苗转移到hoagland培养液培养，每隔三天更换一次营养液，培养21天后，进行收获。去离子水将根部冲洗干净，用剪刀将根和茎在分节处剪断，分别置于自封袋中备测。2、大田试验将166份试验材料种植于位于德州德城区的德州市农业科学院试验田，采用随机区组设计，设置三次重复，行长2m，行距25cm，株距10cm，常规田间管理。待幼苗生长至两叶一心期，采用根钻法对根系进行取样。去离子水将根部冲洗干净，用剪刀将根和茎在分节处剪断，分别置于自封袋中备测。二、表型测定将各单株侧根逐一分开，不重叠、不交叠置于装有去离子水的透明根盘中，利用winrhizola6400xl根系专用大幅面透视扫描仪扫描根系，获取各单株根系图片。然后用winrhizopro软件分析获得各样品的根系总长度(totalrootlength，rtl)、根系表面积(rootsurfacearea，rsa)、根系平均直径(rootaveragediameter，rad)、根系体积(rootvolume，rv)、根尖数(roottipnumber，rtn)。三、基因型测定利用ctab法提取166份小麦材料叶片基因组dna。采用1.0％琼脂糖凝胶电泳和uvs-99微量分光光度计对提取的基因组dna进行质量和浓度检测，将合格样品的dna用于snp分型。采用博奥生物有限公司(http://www.capitalbio.com/)开发的共包含81587个snp标记的90kiselectsnp芯片对供试材料进行分析。利用illuminasnp基因分型平台对供试材料进行基因分型。对81587个snp标记进行筛选，剔除其中没有染色体定位信息、缺失率大于50％、杂合率大于50％及最小等位基因频率(minorallelefrequency，maf)小于0.05的标记，最终得到高质量snp标记用于gwas分析。使用powermarker3.25软件计算maf和多态性信息含量(polymorphisminformationcontent，pic)(lui和muse，2005)。四、群体结构分析与亲缘关系分析采用structure2.3.4软件(pritchard等，2000)对166份小麦品种(系)进行群体结构分析，所用snp标记为5624个在全基因组上均匀分布且maf大于0.05的标记。采用structure2.3.4软件的混合线性模型对166份小麦品种(系)进行群体结构分析，k为亲缘关系影响，k设置为2到7，每个k值运行3次，寻找最佳k值。若似然值随k值增大而增大时，则用δk来确定最佳分组k值(evanno等，2005)。设定最佳k值，再次进行贝叶斯聚类分析，根据等位基因频率，品种被分配到不同的亚群。采用tassel5.0软件进行品种(系)间亲缘关系分析。五、将高质量的snp标记、群体结构分析结构与亲缘关系分析结果用于全基因组关联分析，从中选取小麦根系相关性状的snp分子标记1、性状与标记的关联分析采用tassel5.0软件的混合线性模型(mixedlinearmodel，mlm)，将群体结构矩阵(q)和基因型作为固定变量，亲缘关系(k)和误差作为随机变量，进行根系性状的gwas分析，并在p<0.001水平对标记进行显著性检验。2、结果与分析2.1群体结构分析gwas研究中出现假阳性的最主要原因是群体分层(kump等，2011)，而混合线性模型法能很好的降低由结构分层造成的假阳性(poland等，2011)。当亚群数k取3时模型取得最大δk值(附图1)，表明166份小麦材料构成的群体存在一定程度的群体分层，并且可以分为3个亚群，分别命名为：pop1、pop2和pop3(附图2)。3个亚群分别含有62份、54份和50份材料。2.2小麦根系相关性状的全基因组关联分析gwas分析结果显示，水培环境下，共检测到15个稳定的与根系性状显著关联的标记(p<0.001)。与rtl显著关联的标记有3个，分布在6a、2d和4b染色体上，分别可解释10.32％、11.84％和10.37％的表型变异；与rsa显著关联的标记有3个，分布在6a、5b和4b染色体上，分别可解释10.86％、10.5％和10.49％的表型变异；与rad显著关联的标记有6个，分布在1b、2b、3b、2a、7a和3a染色体上，分别可解释23.86％、16.95％、8.4％、31.3％、30.66％和30.66％的表型变异；与rv显著关联的标记有5个，分布在6a、7a、2b、2a和4b染色体上，分别可解释10.14％、12.59％、11.05％、11.09％和10.47％的表型变异；与rtn显著关联的标记2个，分布在2a和1a染色体上，分别可解释13.37％和11.05％的表型变异。6a染色体上的标记bs00062781_51，4b染色体上的标记wsnp_ra_rep_c69724_67278233与rtl、rsa和rv均显著相关(表2)。表2水培条件下与根系性状显著关联的snp标记table1markerssignificantlyassociatedwithrootcharacteristicsgrowninnutritionsolution大田环境下，共检测到10个稳定的与根系性状显著关联的标记(p<0.001，显著相关，就是指，当检测的p<0.001时，检测到的snp标记)。与rtl显著关联的标记有2个，分布在3a和5b染色体上，分别可解释8.6％和9.8％的表型变异；与rsa显著关联的标记有3个，分布在3a和5b染色体上，分别可解释8.49％、10.27％和9.86％的表型变异；与rad显著关联的标记有2个，分布在2d和7a染色体上，分别可解释9.7％和9.44％的表型变异；与rv显著关联的标记有4个，分布在3a、5a、7a和2b染色体上，分别可解释9.62％、9.91％、9.88％和10.31％的表型变异；与rtn显著关联的标记2个，分布在7a和5b染色体上，分别可解释9.89％和9.27％的表型变异。3a染色体上的标记wsnp_ex_rep_c104884_89459472，与rtl、rsa和rv均显著相关，5b染色体上的标记tdurum_contig47576_291与rtl和rsa显著相关(表3)。表3大田条件下与根系性状显著关联的snp标记table3markerssignificantlyassociatedwithrootcharacteristicsgrowninfield注：-，无功能注释六、将与根系性状关联的snp分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，获得与根系性状相关的候选基因；将获得的候选基因进行基因功能分析，筛选出功能与根系性状相关的候选基因，进一步确定与根系性状关联的snp分子标记；将与根系性状显著关联的snp标记的延伸序列在ncbi数据库中进行比对检索，共检索到15个基因(表4)。表4通过snp标记检索到的基因table3genesblastedthroughsnps其中：与根系性状相关的基因为：myosin，herc2、cullin-3a、arfgap。其中：arfgap与cullin蛋白与小麦根系中生长素的运输与分配有关，herc2与myosin与根毛生长有关。所述的snp1为1b染色体上标记excalibur_rep_c66394_199；所述的snp2为3a染色体上标记wsnp_ex_c361_707953；所述的snp3为2d染色体上标记kukri_rep_c101148_401；所述的snp4为2b染色体上标记gene-0918_159。将所述的snp1分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，所述的序列blast到的候选基因编码具iq基序的钙调素结合蛋白(myosin)；将所述的snp2分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，所述的序列blast到的候选基因编码泛素连接酶e3(herc2)，单亚基e3泛素连接酶；将所述的snp3分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，所述的序列blast到的候选基因编码cullin-3a蛋白(cullin-3a)，多亚基e3成员scf复合体的亚基；将所述的snp4分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，所述的序列blast到的候选基因编码arfgap，adp核糖基化因子gtp水解酶激活蛋白。本发明利用大田与水培两种条件，对166份小麦品种(系)的苗期根部性状进行了gwas分析。水培条件下，共检测到15个稳定的与根系性状显著关联的位点，在大田环境下，检测到10个稳定的与根系性状显著关联的位点。这些位点分布在染色体1a、1b、2a(3个)、2b(2个)、2d(2个)、3a(3个)、3b、4b、5a、5b(3个)、6a、7a(4个)上。将上述snp分子标记的延伸序列在ncbi数据库中进行blast检索，获得与根系性状相关的候选基因；将获得的候选基因进行功能分析，进一步确定与根系性状关联的4个snp分子标记：snp1为1b染色体上标记excalibur_rep_c66394_199；所述的snp2为3a染色体上标记wsnp_ex_c361_707953；所述的snp3为2d染色体上标记kukri_rep_c101148_401；所述的snp4为2b染色体上标记gene-0918_159。实施例2：本发明基于关联到的snp与挖掘到的候选基因，开发设计了一套kasp引物，用于小麦snp3位点基因型的检测。kasp是竞争性等位基因特异性pcr(kompetitiveallelespecificpcr)的缩写，可在广泛的基因组dna样品中(甚至是一些复杂基因组的dna样品)，对snps和特定位点上的indels进行精准的双等位基因判断。所述的kasp引物包括引物a(seqidno.5),引物b(seqidno.6)和引物common(seqidno.7)；5μlpcr反应体系包括：1.5μldna(10ngμl–1),kaspmastermix2.5μl，0.07μlkaspprimermix和1μlddh2o。扩增程序为，94℃热激活15min；94℃变性20s,61℃退火和72℃延伸60s,10个循环(touch-down,每循环降低0.6℃)；94℃变性20s,55℃退火和72℃延伸60s,30个循环。将扩增产物进行荧光信号扫描，采用klustercaller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定小麦位点snp3：kukri_rep_c101148_401基因型。以18份不同普通dna为样本，进行kasp检测，其结果如图所示，图中每圆点都对应着一个供试品种，每组混合引物均将供试品种分成两组，每组带有不同的颜色，蓝色代表该基因具有fam标签序列，红色代表该基因具有hex标签序列。即分成了两种不同基因型：红色为第51个碱基为a的基因型，蓝色为第51个碱基为g的基因型。结合水培与大田试验结果发现，显示红色信号的品种根系直径大于显示蓝色信号的根系品种。即标记kukri_rep_c101148_401第51个碱基为a的小麦根系直径大于第51个碱基为g的根系直径。本发明还保护一种筛选大直径根系小麦的方法，检测待测小麦的染色体2d上的80cm位置是否含有snp3位点，并且检测该位点的基因型；若基因型判定为第51个碱基为a，则判定所述的待测小麦为大直径根系。snp4分子标记在大直径根系小麦筛选中的应用。本发明在不同环境条件下，进一步对不同小麦群体根系性状进行gwas分析，寻找与根系性状相关联的优异等位变异，将极大的提高育种工作中对根系性状优良基因型选择的准确性和预见性。而控制根系性状目标基因的挖掘对深入了解小麦根系生长发育分子遗传机制的研究具有重要意义。通过上面具体实施方式，所述
技术领域：
：的技术人员可容易的实现本发明。但是应当理解，本发明并不限于上述的几种具体实施方式。在公开的实施方式的基础上，所述
技术领域：
：的技术人员可任意组合不同的技术特征，从而实现不同的技术方案。序列表<110>德州市农业科学研究院;中国农业科学院作物科学研究所<120>小麦根系相关性状的snp分子标记及应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>102<212>dna<213>小麦(triticumspp.)<400>1gctagccaagccatggccatgatcaacagattgcatgaggaaaaggctgcacatgcagat60ggaagcactacaatatcttaggatgatggaagagcaggctga102<210>2<211>202<212>dna<213>小麦(triticumspp.)<400>2gatgttaaatcaggaagttgaaagactccgcggacaggtcgatagtctgaggcaccggtg60tgaggctcaagaacttgagctacagaagtctgctaagaaaagtacaagaggccatgactc120tggttgcagaggagtctgcgaagtccaaagctgctaaggaagtcataaaagccctaacag180cacagctcaaggacatggctga202<210>3<211>102<212>dna<213>小麦(triticumspp.)<400>3ggtccaggaccctcctggacttcatgatccaacttgctgctgaacttgtcagttgaagtg60gaaagcgtcgctgtcggatatgtccttgctcatgggctcctt102<210>4<211>98<212>dna<213>小麦(triticumspp.)<400>4agttagttagttagttagtcatccacacacgrtgatgacggtactcagtattcttgtatc60ccacatctgttgtgctagctgagtctcatccatattat98<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(triticumspp.)<400>5gcgacgctttccacttcaat20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(triticumspp.)<400>6gcgacgctttccacttcaac20<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列(triticumspp.)<400>7tcctgcttctccggctca18当前第1页12当前第1页12