一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的方法与流程

本发明属于分析检测试剂盒技术领域，尤其涉及的是一种杂交瘤细胞5过滤灌流培养制备抗体的方法。

背景技术：

杂交瘤单抗广泛应用于医疗诊断试剂，以及各种分析检查试剂盒中。国内各实验室也自制多种杂交瘤抗体。杂交瘤细胞是半贴壁细胞，既可以10细胞瓶贴壁培养，又可以细胞反应器悬浮培养。如要大量制备单抗，须进行细胞反应器杂交瘤细胞高密度培养。工业制备单抗使用生物反应器微载体悬浮/固定床培养大量生产；或中空纤维反应器灌流培养。单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。

诊断试剂市场需求抗体种类多，而用量少，阶段使用量均在几百毫克15到1g左右；所以市场上大部分诊断试剂抗体使用小鼠生产腹水单抗，腹水中有宿主其他鼠源抗体难以分开，细胞培养基添加的牛血清和腹水中的其他鼠源抗体，都会导致诊断单抗假阳性。而为减少培养血清中的牛igg对单抗的影响，实验室使用半透膜细胞培养瓶培养，工业使用微囊包裹杂交瘤细胞反应器培养法。现在无血清培养基的大量运用，彻底解决了培养血20清中牛igg混杂在产品抗体中难题，是杂交瘤单抗培养制备方向。由于杂交瘤贴壁特性，一般使用杂交瘤细胞贴附微载体后悬浮培养需要复杂昂贵的微载体悬浮培养细胞反应器；若驯化半贴壁杂交瘤细胞为悬浮细胞，需要在无血清培养基中逐代驯化筛选高产量的克隆细胞系，费时费力，如果不是大品种高产量的单抗品种，很少有用生物反应器培养。25

因此，市场大量需求制备几百毫克到1g生产规模，无血清无宿主抗体干扰的单抗培养装置，满足小规模多种类简单方便的无血清培养需求。

技术实现要素：

为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的方法。

本发明的技术方案如下：

一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的方法，包括以下步骤：

步骤1：将1gcytodex1微载体100ml无钙镁离子磷酸盐缓冲液浸泡过夜，上清倾倒换液；121度30分钟高压灭菌后；在超净台中倾倒pb上清，使用无钙镁离子thermofisher无血清杂交瘤培养基浸泡过夜；

步骤2：超净台中2e7杂交瘤细胞悬浮于60-100ml无血清培养基中；

步骤3：消毒浸泡好1g微载体约4.3e6个微球悬浮于60-100ml无血清培养基中；

步骤4：分别吸取微载体和细胞混合入过滤器，实现细胞接种一个微载体；

步骤5：持续补料和出液，经过循环过滤灌流培养3-4天，细胞密度达到1-4e6/ml,透气袋中的培养基营养成分消耗，乳酸和氨堆积，需要持续向储液透气袋中补充无血清培养基和dmem/f12混合培养基；过滤灌流出的培养液不再循环回到储液透气袋，通过滤器底部三通阀排出和收集；通过无血清培养基不断淋洗去除原细胞培养体系中的血清，为下一步抗体收集准备；

步骤6：6-7天后滤器中细胞密度1e7/ml,微载体上细胞已铺满表面，控制维持灌流培养基葡萄糖含量为0.8g/l、乳酸含量<2g/l、氨含量<8mm,抑制细胞继续扩增，加大抗体分泌，过滤出澄清

的抗体培养液收集。

上述步骤4中，还包括步骤401：细胞接种后小流速循环持续过滤灌流培养几天，每天透气袋补充60ml无血清培养基。

所述步骤401之后还包括步骤402：每天取微载体和细胞观察细胞培养状态，和监测葡萄糖和乳酸；如葡萄糖低于1g/l,通过补料补加无血清培养基和含糖和0.4mm谷氨酰胺dmem/f12培养基。

上述步骤5中，无血清培养基和dmem/f12混合培养基的比例为1:1～1：3，速度为100ml/天。

本发明解决了普通贴壁杂交瘤细胞，小规模大量制备单抗，开发出需要昂贵的细胞反应器装置的问题，选用市场上一次性产品/医疗产品，制成密闭循环培养系统，解决了杂交瘤染菌安全问题，细胞交叉污染，单抗混杂培养基血清牛抗，灌流方式培养条件适用不同的细胞株，单抗产品生产安全重复性好。

附图说明

图1为本发明方法流程图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

如图1所示，本发明提供一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的方法，包括以下步骤：

步骤1：将1gcytodex1微载体100ml无钙镁离子磷酸盐缓冲液浸泡过夜，上清倾倒换液；121度30分钟高压灭菌后；在超净台中倾倒pb上清，使用无钙镁离子thermofisher无血清杂交瘤培养基浸泡过夜；

步骤2：超净台中2e7杂交瘤细胞（可以是传统细胞瓶贴壁培养，或搅

拌瓶悬浮细胞细胞系）悬浮于60-100ml无血清培养基中；

步骤3：消毒浸泡好1g微载体约4.3e6个微球悬浮于60-100ml无血清培养基中；

步骤4：使用双泵分别吸取微载体和细胞，泵后通过医用三通阀混合入过滤器，实现3-10个细胞接种一个微载体。由于微载体过滤堆积过程不限制体积，所以接种比例可以任意调节，从1个细胞/球到20细胞/球。由于微载体细胞堆积效应，细胞与微载体挤压在一起，形成良好接触环境，贴壁、半贴壁、悬浮细胞在无血清培养基环境下都能生长。

上述步骤4中细胞接种后小流速循环持续过滤灌流培养几天，每天透气袋补充60ml无血清培养基；每天取微载体和细胞观察细胞培养状态，和监测葡萄糖和乳酸；如葡萄糖含量低于1g/l,通过补料三通补加无血清培养基和含糖和0.4mm谷氨酰胺dmem/f12培养基。

步骤5：清洗和换液：持续补料和出液，经过循环过滤灌流培养3-4天，细胞密度达到1-4e6/ml,透气袋中的培养基营养成分消耗，乳酸和氨堆积，需要持续向储液透气袋中补充无血清培养基和dmem/f12混合培养基比例1:1～1：3速度100ml/天;过滤灌流出的培养液不再循环回到储液透气袋，通过滤器底部三通阀排出和收集。通过无血清培养基不断淋洗去除原细胞培养体系中的血清，为下一步抗体收集准备。

步骤6：抗体收集制备：6-7天滤器中细胞密度1e7/ml,微载体上细胞已铺满表面，控制维持灌流培养基葡萄糖含量为0.8g/l、乳酸含量<2g/l、氨含量<8mm,抑制细胞继续扩增，加大抗体分泌，过滤出澄清的抗体培养液收集。

进一步而言，本发明提供的一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的方法所使用的杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的装置包括，控制培养温度装置（普通co2细胞培养箱），细胞换气装置（透气细胞培养袋、中空纤维气体交换器），过滤灌流培养器、微载体细胞取样口及过滤灌流循环泵。

滤灌流循环泵吸取透气细胞培养袋培养基穿过中空纤维气体交换器与过滤灌流培养器出口相连接；中空纤维气体交换器出口连接医用三通阀，医用三通阀向下与滤灌流循环泵和过滤灌流培养器进口连接，同时医用三通阀另一进口连接微载体悬浊液注射器7及杂交瘤细胞液注射器中的混合液的入口；过滤灌流培养器上方设有微载体取样口连接医用三通阀便于无菌取微载体细胞；过滤灌流培养器内部还设置一细胞微载体滤板；在中空纤维气体交换器进口处还设置有医用三通阀，设置医用三通阀的一端连接灌流培养基进口；在过滤灌流培养器出口处同样设置有医用三通阀，设置医用三通阀的一端连接有废液出口；

综上所述，培养环境温度装置：用于放在co2细胞培养箱中，控制细胞培养温度及气体co2浓度，培养环境温度装置为管道化密闭设置，同时保持在无菌状态。透气细胞培养袋及中空纤维气体交换器中使用无菌透气细胞袋储存培养液，同时培养环境温度装置中的氧气通过透气细胞培养袋1的膜进入培养液，细胞代谢的co2也可透出，实现培养基换气，当细胞生长平台期时，仅靠透气细胞培养袋有限的换气表面不足以支撑旺盛的需要，培养循环流路中泵前接入0.1um中空纤维交换器（即中空纤维交换柱），可以扩大换气面积增强换气效果。

综上所述，细胞接种微载体时，同时推进并联微载体悬浊液注射器及杂交瘤细胞液注射器中液体，大量生产时将注射器换成流量混合泵将微载体和细胞分由两条流路依靠泵流量混合泵使微载体与细胞流量精确比例混合，精确的流量混合泵通过流量控制混合实现每个微载体平均分配3-10个细胞，将微载体悬浊液及杂交瘤细胞液混合好的细胞微载体混合液，滤入微载体细胞过滤灌流培养器，培养基透过细胞微载体滤板，细胞和微载体在细胞微载体滤板上层叠堆积，强制细胞微载体接触，实现细胞附着微载体，并在微载体表面伸展贴壁。贴壁4-8小时期间循环泵持续灌流微载体细胞滤层，保证了细胞换气和换液。解决反应器微载体细胞贴壁剪切力大，细胞微载体接触机会少，贴附不均匀。

综上所述，微载体细胞过滤灌流培养器：选用一次性滤器，可高压蒸汽消毒的透明工程塑料滤壳，滤板直径60mm，材质无热原纤维素滤板滤腔体积60ml。

综上所述，细胞微载体滤板让培养液透过，随着过滤，微载体和细胞在细胞微载体滤板的滤膜上层层堆积，细胞与微载体相对固定，实现细胞按混合比例接种微载体设计。4-24小时贴壁过程中，持续低速循环培养液过滤细胞微载体滤层，保持细胞溶氧和营养，带走废物，利于细胞贴壁及伸展生长。随着细胞增加加大循环培养液速度和体积，滤除废物增加营养，综上所述，微载体细胞取样口：通过微载体细胞过滤灌流培养器上的微载体细胞取样口每天使用无菌注射器通过三通阀取微载体细胞观察，并检测ph和葡萄糖，乳酸代谢。医用三通阀：1、设置在灌流培养基进口用于增加新鲜培养液；2、三通阀连接滤灌流循环泵进口，中空纤维气体交换器出口，微载体悬浊液注射器及杂交瘤细胞液注射器中的混合液的入口；3、废液出口位于过滤灌流培养器出口与透气细胞培养袋的回流口；4、三通阀在微载体细胞取样口上，便于带有鲁尔接头的注射器无菌取样微载体细胞。

在上述内容的基础上，进一步而言，使用本发明的方法进行大量生产时，可以设置流量混合泵分别将微载体悬浊液及杂交瘤细胞液通过流量梯度混合，可精确控制每个微载体与确定个数细胞接触，通过过滤使微载体和细胞截留和堆积在过滤培养器中，强制细胞和微载体保持接触状态，接种贴壁期间保持培养液过滤灌流，维持溶氧和营养带走代谢产物和co2，实现稳定可重复过滤灌流培养状态。由于细胞密度高，生成的单抗浓度也高，过滤灌流透出收获液通过滤膜，得到澄清收获产品。

本发明解决了杂交瘤单抗细胞培养长时间，高密度，抗体高浓度，低成本制备难题：本发明的优点：1、培养面积大细胞产量高，而生长空间小细胞密度高，产物抗体浓度高，球型表面微载体贴壁培养方式，是目前公认的最大比表面贴壁细胞培养方式，国际上球型微载体生物反应器成功放大到万升细胞反应器。2、1g微载体培养表面4400cm2大于5个850cm2细胞滚瓶；3、使用的小滤器上方60ml空间容纳>1g微载体,相当于5个滚瓶细胞产量，聚集在60ml体积内，相当于1/10细胞瓶培养体积,细胞密度高十倍；4、由于细胞密度高，单抗浓度高，随着培养时间延长单抗产量高，培养基利用率提高。

本发明微载体接种细胞均匀，改善了微载体生物反应器间歇搅拌贴壁出现的空球和满球现象。流量混合泵分别将细胞和微载体通过流量梯度混合，可精确控制每个微载体与确定个数细胞接触，通过过滤使微载体和细胞截留和堆积在过滤培养器中，强制细胞和微载体保持接触状态；培养方式高效：微载体细胞过滤方式实现小体积高密度细胞培养，将十倍细胞密度所需要的营养、o2和代谢的废物通过循环泵输送：微载体过滤灌流培养方式；细胞贴在微载体上而微载体过滤截留在滤器中，细胞没有搅拌剪切力影响，富氧的培养液连续流过微载体细胞堆积层，控制过滤灌流速度满足细胞生长需求。过滤培养进口装置带有医用三通阀连接补充新鲜培养基，出口与收集装置相连带走代谢产物及抗体。

细胞培养条件易于控制和重复：灌流培养不断加入新鲜培养基，随时清除细胞代谢产物，增加营养物质，维持细胞活率和状态，可以长时间高密度收集杂交瘤抗体,堆积过滤形式防止细胞长满后脱落；灌流实现细胞分泌抗体随时收集排出培养环境，防止细胞分泌的抗体长期滞留在37摄氏度环境被降解。

微载体在显微镜下透明和表面贴附细胞特性，便于随时取样监测细胞状态和培养条件，过滤灌流滤器上有注射器取样口，随时取样观察细胞贴壁微载体状态和每天取样监控培养液葡萄糖消耗、乳酸堆积，细胞数和抗体产量。

本发明选用thermofisher无血清杂交瘤培养基和基础培养基

dmem/f12混合过滤灌流培养，消除培养基中牛抗体对杂交瘤抗体假阳性干扰，提高杂交瘤抗体质量。

本发明使用透气袋配合微载体过滤灌流培养装置，无血清培养基减少鼠类动物感染疾病给产物带来的污染;避免鼠/牛的其它抗体的存在;培养中的过程参数优化、细胞损伤和保护、营养物质利用和有害副产物的形成、细胞生长和单抗分泌的动力学以及长期培养的稳定性等问题，满足诊断试剂厂和实验室对普通贴壁细胞制备单抗的需求。本发明提供一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的装置，杂交瘤单抗细胞培养长时间、高密度，制备出低成本不含血清杂质的高浓度抗体，适合贴壁杂交瘤细胞抗体小量制备，装置简单经济，使用普通杂交瘤细胞接种微载体，使用过滤灌流长时间培养，实现细胞高密度，高活率，收获高浓度抗体，制备几百毫克到克级单抗。

本发明杂交瘤细胞贴附微载体上，在滤器中过滤灌流培养，使用蠕动泵管和医用三通阀连接透气袋和过滤灌流滤器，蠕动泵将透气袋中的培养基泵入滤器，灌流过微载体细胞堆积层，带来溶氧和营养，带走代谢废物和co2，随后培养基汇入透气袋，新旧培养基交换，co2透出透气袋，溶氧溶入培养基。当培养后期，细胞数量增多后，使用医用三通阀从蠕动泵前吸入新鲜的培养基，滤后培养基通过透气袋三通阀排出循环，泵前流路加入透气用中空纤维，增加溶氧满足大量细胞生长消耗。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。