耐镉型布丘氏菌属内生菌及其在镉污染水体修复中的应用的制作方法

本发明属于植物提取修复生物强化技术领域，尤其涉及一种耐镉型布丘氏菌属内生菌在镉污染水体修复中的应用。

背景技术：

植物提取(phyto-extraction)修复技术是指利用植物提取环境中重金属并且转移到地上部分，是一种原位环境修复技术，具有环境友好、无二次污染等优点而受到学术界的青睐。超积累东南景天是中国原生的镉超积累植物，最初在浙江省衢州市古老的矿山土发现，能够有效地提取土壤中的镉元素，在土壤环境中其地上部分镉的积累量达到900mg/kg，水培环境中其地上部分镉的积累量达到6000mg/kg，对重金属的积累能力是超富集植物遏蓝菜的十几倍。和传统的超积累植物相比，东南景天生物量大，易繁殖，是污染环境中提高植物提取修复效率的良好材料。重金属除了对土壤造成污染外，对我国各大江湖库也造成了污染，并且已经开始影响到水体的质量。超积累植物能够提取水体中的重金属，减少重金属在水体中的迁移量，降低重金属对水体的污染水平，其修复的可行性和有效性逐渐得到加强，前景十分广阔。但是超积累东南景天具有生长速率比较慢，生物量比较小，适应性比较弱，利用微生物强化方法可以提高超积累东南景天的生物量，从而提高植物提取的修复效率。

植物内生菌是指定殖在植物体内但不危害植物生长的细菌的统称，其在植物提取修复上的应用潜力成为国内外研究的热点。内生菌可以直接或者间接的方式促进植物生长，比如通过固氮为宿主提供氮素，分泌铁载体为宿主提供铁和其他元素，分泌生长素等促进植物的生长等，从而提高超积累植物体内重金属的积累。但是目前发现的比较重要的促生内生菌主要集中在肠杆菌属(enterobacter),巨大芽孢杆菌属(baccillusmegaterium),乙酸钙不动杆菌属(acinetobactercalcoaceticus),假单胞菌属(pseudomonas)，鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas),慢生根瘤菌属(bradyrhizobium),拉恩氏菌属(rahnella)等,种类有限，应用于污染水体修复的微生物则更少。

综上所述，分离、纯化和筛选高效的内生菌，并且接种内生菌可以有效的定殖在植物体内，这种生物强化方法可以建立植物-微生物良好的互作关系，充分挖掘有价值的超积累植物内生菌，丰富超积累植物内生菌的种类，提高植物提取效率，对于应用超积累植物修复污染水体具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种耐镉型布丘氏菌属内生菌及其在镉污染水体修复中的应用。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种耐镉型布丘氏菌属内生菌，该内生菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为布丘氏菌属sasr13(buttiauxellasp.sasr13)，保藏编号为cctccno：m2017639。

本发明进一步提供了所述内生菌制备菌液的方法，包括下述步骤：利用lb斜面培养基活化所述布丘氏菌属sasr13内生菌，在37℃恒温培养箱中24h获得菌体斜面；将活化的菌种接入lb液体培养基进行扩繁，在36h时内生菌的活性达到最大值；离心去上清液，用无菌磷酸缓冲液清洗并制得菌悬液，调节菌液od600为1.0-1.2。

本发明还提供了将制备获得的菌液用于超积累东南景天修复镉污染水体的方法，包括以下步骤：

(1)取若干长势一致且健壮的超积累东南景天枝条，以清水预培养一周；待生根1～2cm后将根系浸入所述菌液中，接种2h；

(2)将接菌后的东南景天苗放入含镉污水中水培，培养1个月后收获植物；

所述含镉污水中镉浓度为25μm，并在含镉污水中添加了营养液和菌液；其中，营养液的成分及其在含镉污水中的终浓度为：k2so4，0.7mmol/l；kcl，0.1mmol/l；ca(no3)2·4h2o，2mmol/l；mgso4·7h2o，0.5mmol/l；kh2po4，0.1mmol/l；h3bo3，10μmol/l；mnso4·h2o，0.5μmol/l；znso4·7h2o，0.1μmol/l；(nh4)4moo24·4h2o，0.01μmol/l；20μmol/lfe·edta；水培过程中，每3天添加一次菌液，使含镉污水中的菌液浓度维持在10⁶cfu/ml。

本发明中，植物放置于人工气候室，光照周期为14小时光照，昼夜温度为25/20℃。人工气候室的相对湿度维持在白天70％和晚上85％。

本发明中，所述步骤(2)中水培时，控制植物密度为400株/m²。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明提供的布丘氏菌属内生菌是一种应用于重金属污染水体修复中的新型内生菌，该菌不具有致病性，有较强的耐镉能力，较高的acc脱氨酶活性，较强的iaa，铁载体分泌能力和溶磷能力。

2、本发明提供的内生菌能够促进根系的生长，提高东南景天的生物量和镉的吸收积累量，解决了植物提取修复技术中植物生长缓慢，生物量小的缺陷，增强了东南景天的环境适应性。

3、本发明操作简单，安全、经济、环保，提高了植物提取效率，有利于对重金属污染水体进行长期、稳定的修复。

附图说明

图1为布丘氏菌属内生菌sasr13的系统发育树分析图；

图2为布丘氏菌属内生菌sasr13的电镜图；

图3为布丘氏菌属内生菌sasr13对东南景天生物量的影响；

图4为布丘氏菌属内生菌sasr13对东南景天重金属镉吸收积累的影响(浓度)；

图5为布丘氏菌属内生菌sasr13对东南景天重金属镉吸收积累的影响(提取量)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

本发明所述耐镉型布丘氏菌属内生菌是从超积累植物东南景天根中分离的，能够增加东南景天的生物量，促进重金属镉的吸收积累，提高水体修复效率。该内生菌的分类命名为布丘氏菌属(buttiauxellasp.)，完整命名为布丘氏菌属(buttiauxellasp.sasr13)，该菌株已于2017年10月30日保藏在位于湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏编号为cctccno：m2017639。

耐镉型布丘氏菌属内生菌的菌株为革兰氏阴性，杆状；在lb培养基上形成菌落特征为：较小的淡黄色圆形菌落，湿润，粘稠，易挑起。培养基的成分为：胰蛋白胨10gl^-1、酵母提取物5gl^-1、氯化钠10gl^-1，ph值7.5。该菌株在lb液体培养基中耐镉浓度3mm，能产生生长素(iaa)，铁载体，acc脱氨酶，具有溶磷能力，抗四环素15mg/l和卡那霉素50mg/l。试验中的检测方法如下：

下述实施例中，植物cd的检测方法：浓硫酸-双氧水消煮，icp-oes；od600的检测方法：紫外分光光度法。

实施例1布丘氏菌属内生菌的分离

(1)培养基

df培养基：每升培养液中含有kh2po44g，na2hpo46g，mgso4·7h2o0.2g，葡萄糖酸钠2g，柠檬酸2g，(nh4)2so42g，组分1、组分2溶液各0.1ml，琼脂15g，溶剂为水，ph值7.2，高压蒸汽灭菌121℃，20min。

其中组分1：h3bo310mg，mnso4·h2o11.19mg，znso4·7h2o124.6mg，cuso4·5h2o78.22mg，moo310mg溶于100ml灭菌蒸馏水中，-4℃保存；

组分2：feso4·7h2o溶于10ml灭菌蒸馏水中，-4℃保存；

df+acc培养基：每升df培养基中加入3mm的acc。

df+acc+cd培养基：在df+acc培养基中加入cd²⁺3mm。

lb液体培养基：每升培养液中含有以蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，溶剂为ph7.0，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。

(2)菌株的分离纯化

从衢州矿山采集长势良好的超积累植物东南景天野生植株，然后用自来水冲洗30min，再用无菌水冲洗3次，每次3min；用无菌吸水纸吸去植物表面水分，再用无菌剪刀将叶片，茎和根分开，将每一部分分别用70％酒精浸3min，无菌水洗3次，3％naocl浸泡2次，每次1min，然后用无菌水冲洗3次，每次2min。称重表面灭菌后的根系和植株地上部，加入10倍体积的无菌磷酸盐缓冲液在无菌研钵中研磨，均浆后静置5min，取悬液进行10倍系列稀释，分别取不同稀释度的悬液100μl涂布于df、df+acc、df+acc+cd平板上，在30℃暗培养。

从不同稀释倍数的平板上选择在形态，色泽和生长速率不同的菌落在df-acc培养基上划线，置于37℃恒温培养箱中培养。

多次划线，直至菌株纯化。将纯化后的单菌落接种于20mllb液体培养基，在32℃，3000rpm培养36h。将长好的菌液0.7ml与40％灭菌甘油0.3ml混合分装于冻存管在-80℃保存。

实施例2目标菌株的分离鉴定和生理生化指标的鉴定

(1)形态特征

该菌株sasr13在lb培养基上呈较小的淡黄色圆形菌落，湿润，粘稠，易挑起。菌株为革兰氏阴性，杆状，在lb液体培养基中耐镉浓度3mm，能产生生长素(iaa)，铁载体，acc脱氨酶，具有溶磷能力，抗四环素15mg/l和卡那霉素50mg/l。

(2)分子生物学鉴定

将sasr13菌株的菌液10000r/min离心收集菌体，利用sigma-aldrich细菌dna提取试剂盒提取dna，并利用引物27f和1429r扩增该菌株的16srdna，引物的碱基序列为：

27f：5’–agagtttgatcctggctcag-3’(用于扩增布丘氏菌属sasr13的引物27f，如seqidno：1所示)

1492r:5’–ggttaccttgttacgactt-3’(用于扩增布丘氏菌属sasr13的引物1429r，如seqidno：2所示)

pcr扩增体系采用25μl反应体系，反应条件为：94℃预变性3min，94℃变形1min，61℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环，72℃延伸5～10min。

电泳检测：1％琼脂糖凝胶电泳，分析pcr产物电泳结果。

将获得的pcr扩增产物纯化后委托上海睿迪生物进行16srdna测序，经测序得到长度为1410bp的16srdna片段(如seqidno：3所示)。通过blast比对布丘氏菌属sasr13，并利mega7.0软件进行系统发育分析。结果表明，菌株sasr13与buttiauxellasp.的16srdna核苷酸序列的同源性在99％以上，所以鉴定该菌株为布丘氏菌属，命名为布丘氏菌(buttiauxellasp.)sasr13，并将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为cctccno：m2017639，保藏日期为2017年10月30日。

(3)生理生化指标鉴定

1.致病性鉴定

在超积累植物东南景天新鲜的破损叶面接种生长活跃时期的上述菌液，以无菌水作为对照，未发现叶片病害特征；用无菌注射器抽取100μl菌液注射到没有病害的洋葱茎内，以无菌水作对照，32℃培养1周，洋葱未致病。

2.耐cd浓度

向lb液体培养基中加入不同体积的cd溶液，配成不同cd浓度的培养液，然后接种10μl对数期菌液，32℃，摇床中3000rpm培养36h，测菌液的od600值，记录上述内生菌在不同cd浓度下的生长情况。

3.分泌iaa能力

植物生长素，也称吲哚乙酸，是刺激植物生长的一种激素。

用salkowski’s试剂微孔板比色法(sarwarandkremer,1995)检测细菌产生iaa。

4.acc脱氨酶活性

有acc(1-氨基环丙烷-1-羧酸)脱氨酶的细菌能通过催化降解植物合成乙烯前体acc而降低植物在逆境下产生胁迫乙烯的水平,从而缓解植物在逆境下遭受的生长抑制。参考(honmam和shimomurat，1978)利用α-酮丁酸来检测内生菌产acc脱氨酶活性。

5.产生铁载体的能力

铁载体是微生物或植物合成并分泌的一种螯合铁，用于摄取铁元素的低分子量化合物。参考(schwynandneilands,1987)利用cas琼脂平板法测得内生菌产生铁载体的能力。

6.溶解磷酸钙的能力

微生物的溶磷能力就是指一些微生物可分泌有机酸类等物质溶解土壤中作物不易吸收的钙磷、铁磷、铝磷等化合物,促进土壤中无效磷的溶解及利用。参考(parkj,bolann,megharajm,naidur,2011)磷酸钙培养基平板法检测细菌溶解磷酸钙的能力。

实验表明内生菌sasr13具有较强的耐镉能力，能在3mm镉浓度的环境下正常生长，iaa的分泌量是22.88μg/ml，acc脱氨酶含量达到38.77μmolα-kb·mg^-1·pro·h^-1，具有较高的铁载体分泌能力和溶磷能力。

实施例3布丘氏菌属sasr13的菌剂制备

(1)菌种活化

利用lb斜面培养基活化培养布丘氏菌属sasr13的菌种，在37℃恒温培养箱中24h，活得获得菌体斜面。

(2)扩大培养

将活化的菌种接入lb液体培养基进行扩繁，恒温摇床上培养，条件设置为32℃，3000rpm，在36h时内生菌的生长速率最快，活性最大。将获得的菌液离心5min，10000rpm，弃上清液。沉淀用无菌磷酸缓冲液清洗，清洗3次。用0.85％无菌nacl溶液调细菌悬浮液od600为1.0-1.2，此时，菌浓度大致为10⁹cfuml^-1。

实施例4内生菌sasr13在镉污染水体修复中的应用

(1)植物培养

超积累植物东南景天取自中国浙江省衢州市的古老铅锌矿山，取若干长势一致且健壮的超积累东南景天枝条，先用去离子水预培养1周让其生根。植物放置于人工气候室，光照周期为14小时光照，昼夜温度为25/20℃。人工气候室的相对湿度维持在白天70％和晚上85％。

(2)布丘氏菌属(buttiauxellasp.)sasr13菌剂的接种

当东南景天苗根系长度大约为1-2cm时，选取健壮且长势一致的苗接种在实施例3中的sasr13菌悬液,即将根系浸没在菌液中2h。

(3)污水培养处理

将接菌后的东南景天苗放入镉污染水体修复装置中进行水体修复试验，以无菌水和镉盐(例如cd(no3)2)配制含镉污水，使含镉污水中的镉浓度为25μm；然后，向含镉污水中添加菌液和无菌的营养液；

其中，控制添加的菌液量，使含镉污水中的菌液浓度在10⁶cfu/ml。添加的营养液成分及各自在含镉污水中的终浓度为：k2so4，0.7mmol/l；kcl，0.1mmol/l；ca(no3)2·4h2o，2mmol/l；mgso4·7h2o，0.5mmol/l；kh2po4，0.1mmol/l；h3bo3，10μmol/l；mnso4·h2o，0.5μmol/l；znso4·7h2o，0.1μmol/l；(nh4)4moo24·4h2o，0.01μmol/l；20μmol/lfe·edta。

水培过程中，每3天添加一次菌液，保证污水中菌液浓度维持在10⁶cfu/ml左右。水培时，控制植物密度为400株/m²，培养1个月后收获植物。

(4)结果分析

1个月后收获植物，与对照相比，在镉污水中接种内生菌sasr13能够促进植物的生长，地上部分和根系的生物量分别提高了39.2％和42.0％。另外，在镉污染水体中接种内生菌sasr13能够提高地上部分和根系的镉积累量，分别提高了26.8％和87.2％。试验结果表明布丘氏菌属sasr13对超积累东南景天生长和镉吸收积累具有很好的促进作用，可以作为植物提取修复的生化强化方法，提高镉污染水体的修复效率。

序列表

<110>浙江大学

<120>耐镉型布丘氏菌属内生菌及其在镉污染水体修复中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>4

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<213>布丘氏菌属sasr13(buttiauxellasp.sasr13)

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