抗DR5的抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗dr5的抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

根据世界卫生组织的研究显示，自1990年到2013年，癌症死亡率从12％上升至15％，已成为仅次于心血管疾病的高死亡率疾病，预测2020年全球癌症新发病例将达到2000万，因癌症死亡达1200万人；因此，人类亟需开发新的癌症治疗药物。

诱导癌细胞凋亡是多种癌症治疗方法之一，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，trail)能与死亡受体(deathreceptor,dr)结合诱导癌细胞凋亡而不会损伤正常组织，因此trail-dr成为抗肿瘤抗体药物研发的热门靶点。trail又称为apo2l，是wiley1995年首次发现的，是继tnf、fasl之后的第三个tnf家族的凋亡分子。trail是一种ⅱ型跨膜蛋白，胞外区可以被金属蛋白酶切下形成可溶性trail，trail在正常人体的各种组织内有广泛的表达，通过与靶细胞表面的受体特异性结合而发挥作用。目前，在人类中已发现5种trail受体：①2个死亡受体dr4(deathreceptor4)和dr5(deathreceptor5)；②2个诱骗受体dcr1(decoyreceptorl)和dcr2(decoyreceptor2)；③1个可溶性受体opg(osteoprotegerin)。其中，dr4和dr5的胞内区拥有完整的死亡结构域，能够诱导细胞凋亡，而dcr1却没有死亡结构域，dcr2也只有一个截短的死亡结构域，均不能传递凋亡信号，opg是这五种受体中唯一的可溶性蛋白，它主要参与骨骼密度的调节。在37℃条件下，trail与dr5结合的亲和力高于其它膜表达的trail受体；因此，在生理状态下，trail更倾向与dr5结合，尤其当内源性trail有限时。dr5高表达于人类癌症，包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌，在正常细胞无或低表达。死亡受体dr4或dr5与trail结合后，形成配体/受体三聚复合物，诱导死亡受体胞浆段死亡结构域(deathdomain，dd)与fas相关死亡结构域蛋白(fas-associateddeathdomainprotein，fadd)c端dd结合，而fadd以其n端死亡效应结构域(deatheffectordomain，ded)与procaspase-8结合，形成dr4/dr5/fadd/procaspase-8死亡诱导信号复合物(death-inducingsignalingcomplex，disc)，促使其中procaspase-8自身催化成有活性的caspase-8，caspase-8活化后，通过2条信号途径传递凋亡信号(非线粒体依赖途径和线粒体依赖途径)。

trail能选择性杀伤肿瘤细胞的特点，使得多个trail受体拮抗剂进入临床开发，其主要分为2类：1)重组trail蛋白；2)拮抗dr4或dr5的抗体。但是，目前这些药物没有一个使临床癌症病人获益。重组trail蛋白的主要缺陷是药物稳定性和靶向性不好，另外一些形式的重组trail蛋白在高剂量下显示出肝毒性。trail受体拮抗剂临床试验失败的主要原因有：1)候选药物的拮抗活性不足；2)许多原代癌细胞对单一抗体治疗有抗性；3)缺乏合适的生物标记物来鉴别病人对trail受体拮抗剂的易感性。目前已进入临床研究的靶向dr5的单克隆抗体有：lexatumumab、drozitumab、conatumumab、tigatuzumab、lby135等，而许多dr5抗体(如drozitumab和tigatuzumab)需要另外添加交联剂(cross-linkingagent)才能在体外达到最佳的活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种抗dr5的抗体及其制备方法和应用，旨在解决现有trail受体拮抗剂类抗肿瘤药物的拮抗活性不足，需要添加交联剂才能诱导细胞凋亡的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种抗体的可变区，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括以下3个互补决定区cdr：

seqidno:1所示的cdr1，seqidno:2所示的cdr2，和seqidno:3所示的cdr3；

所述轻链可变区包括以下3个互补决定区cdr：

seqidno:4所示的cdr1’，seqidno:5所示的cdr2’，和seqidno:6所示的cdr3’。

进一步地，所述重链可变区含有如seqidno:7所示的氨基酸序列，或如seqidno:7所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列；和/或

所述轻链可变区含有如seqidno:8所示的氨基酸序列，或如seqidno:8所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。

另一方面，本发明还提供一种抗体，所述抗体包括恒定区以上述可变区，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区。

另一方面，本发明还提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白含有具有上述可变区的序列；和/或

含有上述抗体的序列，以及协助表达和/或纯化的标签序列。

另一方面，本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述可变区；和/或

编码上述抗体；和/或

编码上述重组蛋白。

进一步地，编码所述重链可变区的核苷酸序列如seqidno:9所示，或如seqidno:9所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的核苷酸序列；和/或

编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:10所示，或如seqidno:10所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的核苷酸序列。

另一方面，本发明还提供一种载体，所述载体具有上述核酸分子。

另一方面，本发明还提供一种基因工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含上述载体；和/或

所述宿主细胞的基因组中整合有上述核酸分子。

另一方面，本发明还提供一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有上述可变区；和/或

含有上述抗体；和/或

含有上述重组蛋白，以及可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶中的至少一种。

另一方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有上述可变区；和/或

含有上述抗体；和/或

含有上述重组蛋白；和/或

含有上述免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。

另一方面，本发明还提供一种上述可变区、上述抗体、上述重组蛋白、上述免疫偶联物在制备抗dr5蛋白的肿瘤药物，或制备检测dr5蛋白的试剂和/或试剂盒中的应用。

最后，本发明一种上述抗体或上述重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括培养宿主细胞，或采用杂交瘤法利用小鼠腹水生产。

本发明提供的抗体的可变区，含有六个特有的互补决定区cdr(见seqidno:1－6)，可特异性识别抗原dr5，具有很高的亲和力和生物活性和，其可诱导细胞凋亡。

本发明提供的抗体具有上述独特的抗体可变区序列，可与抗原dr5结合，具有很高的亲和力和生物活性，其不需添加交联剂就能诱导细胞凋亡；而且其与抗原dr5的特定识别表位不同于trail与dr5的结合位点，可以与trail联合协同诱导细胞凋亡。

本发明提供的抗体用途广泛，可作为抗肿瘤药物(该肿瘤表达dr5蛋白)单独使用，也可与trail联合使用，还可以与常用的肿瘤放疗药物或化疗药物联合使用，或为基础产生的基因工程抗体作为靶向部分，与放射性核素或化学药物或毒素偶联。另外，该抗体用于制备检测dr5蛋白的试剂和/或试剂盒，如elisa检测、westernblot检测和流式细胞检测等领域的相关试剂盒，其灵敏度显著优于现有技术。

附图说明

图1为本发明实施例1中3e73f11抗体的sds-page电泳图；

图2为本发明实施例1中3e73f11抗体的重链和轻链可变区扩增后电泳图；其中，y为阴性对照，m为marker，1为3e73f11抗体的重链，2为3e73f11抗体的轻链；

图3为本发明实施例2中3e73f11抗体的亚型鉴定图；

图4为本发明实施例3中3e73f11抗体的亲和力检测图；

图5为本发明实施例4中无交联剂时3e73f11抗体诱导heparg细胞凋亡的结果图；

图6为本发明实施例4中存在交联剂时3e73f11抗体诱导heparg细胞凋亡的结果图；

图7为本发明实施例5中3e73f11抗体用于流式检测jurkat细胞的结果图；

图8为本发明实施例6中3e73f11抗体用于elisa检测的结果图；

图9为本发明实施例7中3e73f11抗体用于westernblot检测的结果图；

图10为本发明实施例8中3e73f11抗体和trail协同诱导heparg细胞凋亡的结果图；

图11为本发明实施例9中3e73f11抗体检测人血清中dr5浓度的结果图。

图12为本发明实施例10中3e73f11抗体与人dr4无交叉反应结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供一种抗体的可变区，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括以下3个互补决定区cdr：seqidno:1所示的cdr1，seqidno:2所示的cdr2，和seqidno:3所示的cdr3；

所述轻链可变区包括以下3个互补决定区cdr：seqidno:4所示的cdr1’，seqidno:5所示的cdr2’，和seqidno:6所示的cdr3’。

即重链可变区的cdr氨基酸序列为：

cdr1(seqidno.1)：gfdfstcw；

cdr2(seqidno.2)：inpdssri；

cdr3(seqidno.3)：arggtfyamdy；

轻链可变区的cdr氨基酸序列为：

cdr1’(seqidno.4)：qsllnsrtrkny；

cdr2’(seqidno.5)：was；

cdr3’(seqidno.6)：kqsynlpft。

cdr又称互补决定区(complementaritydeterminingregion)，在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。本发明提供的抗体的可变区，含有六个特有的互补决定区cdr，可特异性识别抗原dr5，具有很高的亲和力和生物活性和，其可诱导细胞凋亡。

进一步地，在本发明一实施例中，所述重链可变区含有如seqidno:7所示的氨基酸序列，或如seqidno:7所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区含有如seqidno:8所示的氨基酸序列，或如seqidno:8所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。

重链可变区氨基酸序列(seqidno.7)：

evkllesggglvqpggslklscaasgfdfstcwmnwvrqapgkglewigeinpdssrinympslkekfiisrdnakntlylqmskvrsedtalyycarggtfyamdywgqgtsvtvss。

轻链可变区氨基酸序列(seqidno.8)：

divmtqspsslavsagekvtmsckssqsllnsrtrknylawyqqkpgqspklliywastresgvpdrfigsgsgtdftltissvqaedlavyyckqsynlpftfgagtklelk。

具体地，可以是与seqidno:7或seqidno:8公开序列至少有80％同源性的氨基酸序列作为替代方案。

另一方面，本发明实施例还提供一种抗体，所述抗体包括恒定区以及上述可变区，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区。

另一方面，本发明实施例还提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白含有具有上述可变区的序列；和/或含有上述抗体的序列，以及协助表达和/或纯化的标签序列。

本发明实施例提供的上述抗体或重组蛋白具有上述独特的抗体可变区序列，可与抗原dr5结合，具有很高的亲和力和生物活性，其不需添加交联剂就能诱导细胞凋亡；而且其与抗原dr5的特定识别表位不同于trail与dr5的结合位点，可以与trail联合协同诱导细胞凋亡。

另一方面，本发明实施例提供一种核酸分子，该核酸分子编码本发明实施例的上述可变区；和/或编码上述抗体；和/或编码上述重组蛋白。

进一步地，在一优选实施例中，编码重链可变区氨的核苷酸序列如seqidno:9所示，或如seqidno:9所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的核苷酸序列；和/或编码轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:10所示，或如seqidno:10所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的核苷酸序列。

编码重链可变区的核苷酸序列(seqidno.9)：

gaagtgaagcttctcgagtctggaggtggcctggtgcagcctggaggatccctgaaactctcctgtgcagcctcaggattcgattttagtacatgctggatgaattgggtccggcaggctccagggaaaggactagaatggattggagaaattaatccagatagtagtaggataaattatatgccatctctaaaggaaaaattcatcatctccagagacaacgccaaaaatacactgtacctgcaaatgagcaaagtgagatctgaagacacagccctttattactgtgcaaggggaggaactttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。

编码重链cdr1核苷酸序列为(seqidno.11)：

ggattcgattttagtacatgctgg；

编码重链cdr2核苷酸序列为(seqidno.12)：

attaatccagatagtagtaggata；

编码重链cdr3核苷酸序列为(seqidno.13)：

gcaaggggaggaactttctatgctatggactac。

编码轻链可变区的核苷酸序列(seqidno.10)：

gacattgtgatgacacaatctccatcctccctggctgtgtcagcaggagagaaggtcactatgagctgcaaatccagtcagagtctgctcaacagtagaacccggaagaactacttggcttggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcataggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgcaagcaatcttataatcttccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa。

编码轻链cdr1’核苷酸序列为(seqidno.14)：

cagagtctgctcaacagtagaacccggaagaactac；

编码轻链cdr2’核苷酸序列为(seqidno.15)：

tgggcatcc；

编码轻链cdr3’核苷酸序列为(seqidno.16)：

aagcaatcttataatcttccgttcacg。

本发明实施例提供的上述核酸分子因核苷酸序列的互补序列或因遗传密码的简并性，可以为与本发明实施例公开的核苷酸序列不同、但编码相同蛋白的序列；也可以是与本发明实施例公开的核苷酸序列至少有80％同源性的序列作为替代方案。

另一方面，本发明实施例提供一种载体，该重组载体具有上述核酸分子。该重组载体可用来表达含有上述重链可变区和轻链可变区的抗体或重组蛋白。

另一方面，本发明实施例还提供一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有上述可变区；和/或含有上述抗体；和/或含有上述重组蛋白，以及可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶中的至少一种。

另一方面，本发明实施例还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有上述可变区；和/或含有上述抗体；和/或含有上述重组蛋白；和/或含有上述免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。

另一方面，本发明实施例还提供一种本发明实施例中上述可变区、上述抗体、上述重组蛋白、上述免疫偶联物在制备抗dr5蛋白的肿瘤药物，或制备检测dr5蛋白的试剂和/或试剂盒中的应用。

本发明实施例提供的抗体或重组蛋白用途广泛，可作为抗肿瘤药物(该肿瘤表达dr5蛋白)单独使用，也可与trail联合使用，还可以与常用的肿瘤放疗药物或化疗药物联合使用，或为基础产生的基因工程抗体作为靶向部分，与放射性核素或化学药物或毒素偶联。进一步地，在一优选实施例中，本发明实施例公开了该抗人dr5的单克隆抗体对肝癌细胞系的杀伤效果，可用于其它有dr5表达的多种肿瘤类型的治疗。另外，该检测dr5蛋白的试剂和/或试剂盒，为elisa检测、westernblot检测和流式细胞检测等领域的相关试剂盒，其灵敏度显著优于现有技术。

本发明实施例提供了抗人dr5的单克隆抗体的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，在此基础上利用上述重组载体或宿主细胞可以产生基因工程抗体，其所含的重链和轻链可变区序列与本发明实施例公开的可变区序列是一致的。该基因工程抗体包括但不限于：抗体的功能性片段fab或者是单链抗体，或者是重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段vh-l，或者是重链和轻链的一个或多个cdr的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段，或者是上述抗体和抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。

最后，本发明一种上述抗体或上述重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括培养宿主细胞，或采用杂交瘤法利用小鼠腹水生产。

具体在一优选实施例中，在一实施例中，该制备方法采用小鼠腹水生产单克隆抗体；或采用培养杂交瘤细胞、cho细胞或293f细胞生产所述单克隆抗体。本发明一优选实施例中，提供了小鼠抗人dr5单克隆抗体的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，通过抗体人源化改造，可以获得抗人dr5的人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗人dr5的人鼠嵌合抗体将鼠源单克隆抗体基因的可变区和人的恒定区连接在一起，然后在哺乳动物细胞中进行表达产生；而抗人dr5的人源化抗体则是除了将抗体的恒定区换成人源的之外，更进一步的将可变区的fr区转换成人源的，从而降低免疫原性。由此产生的抗人dr5的人鼠嵌合抗体和人源化抗体将同样具有结合人dr5分子诱导癌细胞凋亡，从而治疗肿瘤的作用。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1

抗dr5的单克隆抗体的制备，本实施例采用杂交瘤法利用小鼠腹水生产抗dr5的单克隆抗体。

用sdr5-fc蛋白抗原(深圳市中科艾深医药有限公司提供，制备方法参考专利201610067931.2)免疫雌性balb/c小鼠(6周龄)，首次免疫使用弗氏完全佐剂进行乳化抗原，第二次免疫开始，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下5～6点注射，每只小鼠注射的抗原量约为100ug。在第3次免疫后10天，对小鼠剪尾采集少量血液进行血清效价elisa检测，选择抗体滴度高(>1:100000)的小鼠进行加强第4次免疫，通过腹腔注射抗原蛋白，每只小鼠注射约100ug。第4次免疫后3～5天，处死小鼠取其脾细胞与sp2/0细胞融合，通过hat培养基培养获得稳定的杂交瘤细胞。通过elisa法筛选得到能分泌dr5抗体的杂交瘤细胞，通过有限稀释的方法进行亚克隆，elisa法筛选得到能分泌dr5抗体的单克隆杂交瘤细胞株(本说明书中，该抗dr5的单克隆抗体统一命名为3e73f11抗体)，通过逐级扩大培养，液氮冻存保种。

腹水抗体制备：雌性balb/c小鼠(8周龄)腹腔注射弗氏不完全佐剂，每只小鼠注射0.5ml，3～5天后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠注射1～5×10⁵个细胞(0.5ml)，注射杂交瘤细胞约11天后处死小鼠，获得腹水。3000rpm，4℃离心10min，去除沉淀，用10倍体积1×pb溶液稀释腹水，混匀后过0.45μm滤膜。通过proteing(proteingsepharose4fastflow,gehealthcare)亲和纯化腹水，得到纯化的dr5抗体蛋白，用bca法测抗体浓度。将纯化抗体跑sds-page(上样量5.4ug)，考马斯亮蓝染色，结果如图1所示：3e73f11抗体含有两条带，一条为重链，一条为轻链。

dr5单克隆抗体杂交瘤细胞的抗体基因可变区测序：收获处于对数生长期的单克隆抗体杂交瘤细胞，trizol裂解进行rna提取，反转录后获得cdna，扩增并获得重链和轻链可变区的dna序列(电泳图如图2所示)，非功能性vk基因去除，克隆至pmd18-t载体，测序，使用imgt/v-quest数据库进行测序结果比对；测序结果和分析如下。

编码重链可变区的核苷酸序列为seqidno.9；

编码轻链可变区的核苷酸序列为seqidno.10；

重链可变区氨基酸序列seqidno.7：轻链可变区氨基酸序列seqidno.8。

经与imgt/v-quest数据库进行比对，重链可变区的cdr氨基酸序列为：

cdr1-imgt：seqidno.1；

cdr2-imgt：seqidno.2；

cdr3-imgt：seqidno.3；

重链的fr区的氨基酸序列为：

fr1-imgt：evkllesggglvqpggslklscaas；

fr2-imgt：mnwvrqapgkglewige；

fr3-imgt：nympslkekfiisrdnakntlylqmskvrsedtalyyc；

fr4-imgt：wgqgtsvtvss。

轻链可变区的cdr氨基酸序列为：

cdr1’-imgt：seqidno.4；

cdr2’-imgt：seqidno.5；

cdr3’-imgt：seqidno.6；

轻链的fr区的氨基酸序列为：

fr1’-imgt：divmtqspsslavsagekvtmsckss；

fr2’-imgt：lawyqqkpgqspklliy；

fr3’-imgt：tresgvpdrfigsgsgtdftltissvqaedlavyyc；

fr4’-imgt：fgagtklelk。

实施例2

抗dr5的单克隆抗体的亚型鉴定。

使用商品化小鼠单克隆抗体isotyping试剂盒(sinobiological，sek003)进行单抗亚型鉴定，结果如图3所示，从图中可知：该3e73f11抗体为igg1型抗体。

实施例3

抗dr5的单克隆抗体的亲和力测定。

使用10ug/mlsdr5-fc蛋白(深圳市中科艾深医药有限公司提供)与传感器进行固化结合，使用sdbuffer(pbs+0.02％tween20+0.1％bsa)配制不同浓度的3e73f11抗体(566.7nm、283.3nm、141.7nm、70.8nm、35.4nm、17.7nm、8.84nm)作为流动相，使用分子间相互作用仪(octetk2，palllifescience)进行亲和力检测，程序设定为：baseline240s，loading360s，baseline2180s，association480s，dissociation480s，使用ahc(anti-higgfccapture)传感器。结果如图4所示，结果显示：3e73f11抗体与dr5的亲和力为3.55e-09(m)，即3e73f11抗体与dr5具有高亲和力。

实施例4

抗dr5的单克隆抗体的体外细胞功能测定。

1、取对数生长期的heparg细胞，胰酶消化，含10％fbs的培养基终止，吹散计数，调整密度至8×10⁴/ml，按100ul/孔加入96孔细胞培养板，即每孔8000个细胞。共接种6×10＝60孔，周围的36孔每孔加入200ulpbs进行液封，防止培养基蒸发。将细胞放置培养箱培养22～24h。

2、取10ml培养液，加2ul5mg/ml放线菌d，即放线菌素d浓度为1ug/ml。

3、抗体稀释：

不加交联剂情况：用稀释液将3e73f11抗体稀释至40ug/ml，以此浓度为起点，按2倍比稀释15个浓度梯度，每个梯度1个复孔，每孔100ul加入板中。

交联剂(anti-mouselggfcantibody)稀释：0.6ulanti-mouselggfcantibody(1mg/ml)+3ml稀释液，稀释至0.2ug/ml。

加交联剂情况：取15个ep管，每管分别加入125ul3e73f11抗体梯度稀释溶液，每管再加入125ul0.2ug/ml交联剂稀释液，混匀。每孔100ul加入板中，设一个复孔。

4、放置培养箱培养18～22小时。

5、以20:1的比例配制mts/pms溶液(promega，g5430)，每孔加20ul，不加盖子放置培养箱3～4h，酶标仪检测a490-a630，最终结果如图5和图6所示。

图5显示，在无交联剂情况下，3e73f11抗体能诱导heparg细胞凋亡，ec50＝0.1856μg/ml。图6显示，在0.1ug/ml交联剂情况下，3e73f11抗体诱导heparg细胞凋亡的ec50下降为6ng/ml。

实施例5

抗dr5的单克隆抗体在流式细胞检测中的应用。

1、收集jurkat细胞(急性t细胞白血病细胞系中一种)，吹散计数，分装5个离心管，每管3×10⁵个细胞，500g离心5min，去上清，分别加入1mlpbs，500g离心5min，去上清。

2、按下表1加入试剂：

表1

放入冰上，孵育，30min。

3、各加入1mlpbs+5％fbs，500g离心5min，去上清，各加入100uldmem培养液+1ulpegoatanti-mouselgg(minimalx-reactivity)antibody(biolegend,405307)，冰上孵育20min。

4、各加入1mlpbs+5％fbs，500g离心5min，去上清。

5、每管加入300ulpbs+5％fbs，重悬，使用贝克曼流式细胞仪(beckmancytoflexcm)检测。

结果如图7所示，从图可知：该3e73f11抗体能与jurkat细胞表面的dr5蛋白结合，应用于流式细胞检测，且检测灵敏度优于商品化阳性对照。因此，其可以用于制备流式细胞检测试剂盒。

实施例6

抗dr5的单克隆抗体在elisa检测中的应用。

酶标板每孔包被25ngsdr5蛋白，4℃包被过夜，经封闭洗板后，加入2倍比稀释的3e73f11抗体，最高浓度为40ug/ml，最低浓度为19.5ng/ml，每孔100ul，37度孵育1h。pbst洗板5次，加入1:5000稀释的hrp-羊抗小鼠igg抗体，37℃孵育45min。pbst洗板5次，每孔加入100ultmb，室温避光反应3min，每孔加入50ul终止液终止，酶标仪测od450。

结果如图8所示，从图可知：该3e73f11抗体可用于elisa检测，其可用于制备elisa检测的试剂盒。

实施例7

抗dr5的单克隆抗体在westernblot检测中的应用。

sdr5蛋白加5×loadingbuffer混合后，煮沸变性6min，跑sds-page，每孔上样20ul，～500ng蛋白/孔，400ma转膜1h，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入3e73f11抗体(3ml5％脱脂奶粉中加入～10ug抗体)4度孵育过夜，pbst洗3遍后加入1:5000稀释羊抗鼠igg二抗，室温孵育45min，pbst洗3遍后加入westernhrp底物(密理博，wblur0500)显影。

结果如图9所示，该3e73f11抗体能用于westernblot检测，可用于制备westernblot检测的试剂盒。另外在日常westernblot实验中应用dr5抗体，发现3e73f11抗体的实验效果优于genetex公司和santacruz公司商品化dr5抗体，货号分别为gtx21675和sc166624。

实施例8

抗dr5的单克隆抗体的抗原结合表位与trail结合位点的关系验证。

1、包被人trail(sinobiological公司，10409-hane，250ug/ml)：4ml包被液+80ul人trail得到浓度为5ug/ml的人trail，用其包被elisa板，每孔100ul，37℃包被2h。

2、取出elisa板，甩净孔内液体，pbst(磷酸盐吐温缓冲液)振荡洗涤5次，30s/次。

3、每孔加入300ul封闭液，37℃孵育2h。

4、配制3e73f11和sdr5-fc-biotin混合液。

60ul3e73f11(2ug/ul)+2mlpbs(磷酸盐缓冲液)，得到2ml60ug/ml3e73f11。

取32支ep管，分为2份，每份16支，配制sdr-fc-biotin；

4ulsdr5-fc-biotin(1.5ug/ul)+200ulpbs，得到200ul30ug/mlsdr5-fc-biotin；100ulsdr5-fc-biotin(30ug/ml)+100ulpbs，得到200ul15ug/mlsdr5-fc-biotin；依次类推，稀释16个梯度。每个梯度加100ul3e73f11，混匀。37℃孵育1h。

5、取出elisa板，甩净孔内液体，pbst振荡洗涤5次，30s/次。

6、加入孵育好的3e73f11+sdr5-fc-biotin混合液，每孔100ul，37℃孵育1h。

7、取出elisa板，甩净孔内液体，pbst振荡洗涤5次，30s/次。

8、每孔加入1:5000稀释的streptavidin-hrp，37℃孵育30min。

9、取出elisa板，甩净孔内液体，pbst振荡洗涤5次，30s/次。

10、每孔加入100ultmb，室温避光反应10min。

11、每孔加入50ul终止液终止，酶标仪测od450。

该elisa设计的工作浓度与对应的od450结果如表2所示。

表2

以上表3的数据结果表明：当过量的3e73f11抗体与少量抗原sdr5结合后，形成的抗原抗体复合物能与包被在酶标板上的配体trail结合，最终产生阳性od值，且od值的大小与受体dr5的量正相关。这说明3e73f11抗体和dr5结合的位点与trail和dr5结合的位点不同，也就是说3e73f11抗体和dr5的结合不影响trail配体与dr5的结合。

另外，还对dr5单克隆抗体与trail协同诱导细胞凋亡进行研究：使用与抗dr5的单克隆抗体体外细胞功能测定中相同的方法，分别在1ug/ml3e73f11或0.5ug/ml3e73f11或0ug/ml3e73f11抗体存在下，使用梯度稀释的人trail诱导heparg细胞凋亡，结果如附图10所示。从图10可知：在0.5ug/ml3e73f11抗体存在情况下，0.013ng/mltrail诱导细胞凋亡水平与无3e73f11抗体存在时0.229ng/mltrail诱导细胞凋亡水平一样，即trail使用剂量下降近18倍。因此，3e73f11抗体能与trail协同诱导肿瘤细胞凋亡。

实施例9

使用3e73f11抗体检测人血清中dr5浓度。

1、用包被液稀释3e73f11至1ug/ml，包被5列fluoro不透明酶标板(thermonunc，446473)，每孔100ul，37℃包被2h。

2、取出板，甩净孔内液体，pbst振荡洗涤5次，30s/次。

3、每孔加入250ul封闭液，37℃孵育1.5h。

4、取出板，甩净孔内液体，pbst振荡洗涤5次，30s/次。

5、用抗体稀释液稀释humandr5(0.5mg/ml，sinobiologicalinc，10465-h08h)，以1000ng/ml起始，稀释16个梯度，每个梯度1个复孔，100ul/孔，37℃孵育1h。

6、取出板，甩净孔内液体，pbst振荡洗涤5次，30s/次。

7、用抗体稀释液稀释dr5兔多抗(1mg/ml，sinobiologicalinc，10465-rp02)至1ug/ml，100ul/孔，37℃，孵育，1h。

8、取出板，甩净孔内液体，pbst振荡洗涤5次，30s/次。

9、用抗体稀释液稀释以1:10000比例稀释donkeyanti-rabbitigg-hrp(abcam,ab7803)，每个梯度分别加入100ul，37℃，孵育，45min。

10、取出板，甩净孔内液体，pbst振荡洗涤5次，30s/次。

11、加入100ul化学发光显色液(thermo，37075)，避光振荡30s，用spectramaxm5检测od425nm。

表3

结果如表3和图11所示，从表3可知：该3e73f11抗体检测人血清中sdr5浓度检测下限可以达到61pg/ml；由图11可知：线性区间在244pg/ml～125ng/ml。

实施例10

检测3e73f11抗体是否与人dr4抗原有交叉反应。

1、用包被液分别稀释dr4和dr5至2.5ug/ml、1.25ug/ml、625ng/ml、312.5ng/ml、156.25ng/ml、78ng/ml、39ng/ml7个浓度，包被96孔板，每孔100ul，4℃包被过夜。

2、pbst振荡洗涤3次，30s/次。

3、每孔加入250ul封闭液，37℃孵育1.5h。

4、pbst振荡洗涤5次，30s/次。

5、用pbs稀释3e73f11至2ug/ml，100ul/孔，37℃孵育1h。

6、pbst振荡洗涤5次，30s/次。

7、用pbs以1:5000稀释羊抗鼠lgg-hrp，100ul/孔，37℃孵育45min。

8、取出板，甩净孔内液体，pbst振荡洗涤5次，30s/次。

9、每孔加入100ultmb，室温避光反应4min。

10、每孔加入50ul终止液终止，测od450。

结果如图12所示：该3e73f11抗体能特异性识别dr5抗原，和dr4抗原没有交叉反应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>深圳先进技术研究院

<120>抗dr5的抗体及其制备方法和应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列（artificial）

<400>1

glypheasppheserthrcystrp

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>人工序列（artificial）

<400>2

ileasnproaspserserargile

15

<210>3

<211>11

<212>prt

<213>人工序列（artificial）

<400>3

alaargglyglythrphetyralametasptyr

1510

<210>4

<211>12

<212>prt

<213>人工序列（artificial）

<400>4

glnserleuleuasnserargthrarglysasntyr

1510

<210>5

<211>3

<212>prt

<213>人工序列（artificial）

<400>5

trpalaser

1

<210>6

<211>9

<212>prt

<213>人工序列（artificial）

<400>6

lysglnsertyrasnleuprophethr

15

<210>7

<211>118

<212>prt

<213>人工序列（artificial）

<400>7

gluvallysleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleulysleusercysalaalaserglypheasppheserthrcys

202530

trpmetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpile

354045

glygluileasnproaspserserargileasntyrmetproserleu

505560

lysglulyspheileileserargaspasnalalysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetserlysvalargsergluaspthralaleutyrtyrcys

859095

alaargglyglythrphetyralametasptyrtrpglyglnglythr

100105110

servalthrvalserser

115

<210>8

<211>113

<212>prt

<213>人工序列（artificial）

<400>8

aspilevalmetthrglnserproserserleualavalseralagly

151015

glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleuasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

serprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargpheileglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserservalglnalagluaspleualavaltyrtyrcyslysgln

859095

sertyrasnleuprophethrpheglyalaglythrlysleugluleu

100105110

lys

<210>9

<211>354

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>9

gaagtgaagcttctcgagtctggaggtggcctggtgcagcctggaggatccctgaaactc60

tcctgtgcagcctcaggattcgattttagtacatgctggatgaattgggtccggcaggct120

ccagggaaaggactagaatggattggagaaattaatccagatagtagtaggataaattat180

atgccatctctaaaggaaaaattcatcatctccagagacaacgccaaaaatacactgtac240

ctgcaaatgagcaaagtgagatctgaagacacagccctttattactgtgcaaggggagga300

actttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca354

<210>10

<211>339

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>10

gacattgtgatgacacaatctccatcctccctggctgtgtcagcaggagagaaggtcact60

atgagctgcaaatccagtcagagtctgctcaacagtagaacccggaagaactacttggct120

tggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatctactgggcatccactagg180

gaatctggggtccctgatcgcttcataggcagtggatctgggacagatttcactctcacc240

atcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgcaagcaatcttataatctt300

ccgttcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa339

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>11

ggattcgattttagtacatgctgg24

<210>12

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>12

attaatccagatagtagtaggata24

<210>13

<211>33

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>13

gcaaggggaggaactttctatgctatggactac33

<210>14

<211>36

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>14

cagagtctgctcaacagtagaacccggaagaactac36

<210>15

<211>9

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>15

tgggcatcc9

<210>16

<211>27

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>16

aagcaatcttataatcttccgttcacg27