一种铜绿假单胞菌‑烟曲霉菌混合生物被膜体外模型的制作方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜体外模型的制作方法。

背景技术：

铜绿假单胞菌及烟曲霉菌是自然界中较常见的细菌及真菌，也是临床常见的机会致致病菌。在实际的临床感染病例中，多重病原微生物混合感染比单一感染更为常见。一项回顾性调查研究表明，肺囊性纤维化（cysticfibrosis,cf）合并感染患者呼吸道中存在多种病原微生物定植，其中以铜绿假单胞菌合并烟曲霉感染最为常见（62%），且这一类型的混合病原感染还见于多种疾病如：糖尿病合并皮肤伤口或足部溃疡迁延不愈、copd或肺cf合并慢性肺部感染、接受肺移植手术等患者人群中。细菌及真菌在宿主体内生长主要有浮游和生物被膜两种形态。相对浮游状态而言，病原菌一旦形成生物被膜，耐药性可较浮游状态提高10-1000倍。多重混合感染过程中一旦形成混合生物被膜，可使病原菌耐药性进一步提高，感染情况更加复杂性。目前国内外对于混合生物被膜的研究尚处于起步阶段，尤其烟曲霉菌和铜绿假单胞菌的混合生物被膜相关研究报道更为少见。对于混合生物被膜的研究首先应从建立体外生物被膜模型开始，对其进行体外生物被膜形态学、生长动力学及药物敏感性等基础性研究，才能进行更深入复杂的体内研究。目前尚未有关于建立相对稳定的烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合菌生物被膜模型的方法学相关报道。因此，本发明主要公开针对这一混合菌生物被膜体外模型的建立方法，为后续针对此类感染的基础研究提供方法学依据。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决日益严峻的铜绿假单胞菌合并烟曲霉菌感染，寻找解决其病原感染的机理，提供一种铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜体外模型的制作方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜体外模型的制作方法，其制备方法包括制备烟曲霉菌孢子悬液、制备铜绿假单胞菌菌悬液和建立混合生物被膜体外模型；

所述的制备烟曲霉菌孢子悬液采用烟曲霉菌株接种至马铃薯葡萄糖琼脂或沙氏琼脂斜面培养基，35~37℃恒温复苏72~120小时后，调节烟曲霉菌孢子悬液浓度为1~5×10ˆ6cfu/ml；

所述的制备铜绿假单胞菌菌悬液采用铜绿假单胞菌菌株接种至lb琼脂培养基，35~37℃复苏24~28小时，调节铜绿假单胞菌菌悬液的终浓度至1~5×10ˆ8cfu/ml；

所述的建立混合生物被膜体外模型是将烟曲霉菌孢子悬液接种于灭菌24孔细胞培养板16~18小时后，再接种铜绿假单胞菌菌悬液，将烟曲霉菌孢子悬液与铜绿假单胞菌菌悬液混合均匀，两者接种的菌液量之比为30~50：1~2，混合后于35~37℃恒温静止培养24~48小时，即得。

优选的，所述的烟曲霉菌株为烟曲霉菌株af293或临床分离烟曲霉菌株，所述的铜绿假单胞菌菌株为铜绿假单胞菌pao1菌株或临床分离铜绿假单胞菌株。

优选的，所述的制备烟曲霉菌孢子悬液采用烟曲霉菌株接种至马铃薯葡萄糖琼脂或沙氏琼脂斜面培养基，35~37℃恒温复苏72~120小时后，用无菌纯水或pbs溶液冲洗马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基收集孢子液，将收集到的孢子液加入到用3-（n-吗啉基）丙磺酸-4-吗啉丙磺酸缓冲后ph为6.9~7.1的rpmi-1640培养基内，用血细胞计数板调节烟曲霉菌孢子悬液浓度为1~5×10ˆ6cfu/ml。

优选的，所述的制备铜绿假单胞菌菌悬液采用铜绿假单胞菌菌株接种至lb琼脂培养基，35~37℃复苏24~28小时，挑取铜绿假单胞菌单一菌落，接种于3-（n-吗啉基）丙磺酸-4-吗啉丙磺酸缓冲后ph为6.9~7.1的rpmi-1640培养基中，35~37℃恒温摇床孵育20~24小时后，用3-（n-吗啉基）丙磺酸-4-吗啉丙磺酸缓冲后ph为6.9~7.1的rpmi-1640培养基将上述培养的菌悬液稀释至od600=0.1~0.12，并通过活菌菌落计数调节铜绿假单胞菌菌悬液的终浓度至1~5×10ˆ8cfu/ml。

优选的，所述恒温摇床的转速为220-250转/分。

优选的，所述的24孔细胞培养板的各孔预先各放置一枚直径为13-15mm的灭菌圆形玻璃细胞爬片或医用硅胶片。

优选的，所述的灭菌圆形玻璃细胞爬片或医用硅胶片需预先用50~100μl，浓度为100~200μg/ml的多聚-l-赖氨酸预包被15~30分钟。

优选的，所述的烟曲霉菌孢子悬液接种于灭菌24孔细胞培养板16~18小时后，再加入铜绿假单胞菌菌悬液，并将其置于35~37℃恒温箱中孵育24~48小时。

优选的，所述的烟曲霉菌孢子悬液与铜绿假单胞菌菌悬液之比为30：1。

本发明突出的实质性进步和显著的特点是：

本发明提供了铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜体外模型，对其进行体外生物被膜形态学、生长动力学及药物敏感性等基础性研究，为后续针对此类感染的基础研究提供方法学依据。

附图说明

图1是本发明实施例2结晶紫染色法定量检测铜绿假单胞菌和烟曲霉菌生物被膜，其中，pa：铜绿假单胞菌生物被膜组；af：烟曲霉菌生物被膜组；af+pa：铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜组。

图2是本发明实施例3光镜下观察24小时铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜的形态学，其中，①、④为烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合生物被膜组；②、⑤为单一烟曲霉菌生物被膜组；③、⑥为单一铜绿假单胞菌生物被膜组。上方图片为光镜下放大100倍，下方图片为光镜下放大400倍的观察结果。

图3是本发明实施例4扫描电镜观察烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合菌生物被膜结构（2000×），①为烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合菌生物被膜；②为单一烟曲霉菌生物被膜；③为单一铜绿假单胞菌生物被膜。

图4是本发明实施例4扫描电镜高倍观察观察烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合菌生物被膜结构（15000×）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

（1）烟曲霉孢子悬液的制备受试烟曲霉菌株af293接种至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，37℃恒温复苏72小时，用8ml无菌纯水冲洗马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基斜面收集孢子。配置用3-（n-吗啉基）丙磺酸-4-吗啉丙磺酸缓冲后ph为7.0的rpmi-1640培养基。将收集到的约8ml孢子液加入到约30ml该rpmi-1640培养基内，用血细胞计数板调节孢子浓度为1~5×10ˆ6cfu/ml,作为建立体外混合生物被膜模型的孢子悬液。

（2）铜绿假单胞菌菌悬液的制备将受试铜绿假单胞菌pao1菌株接种至lb琼脂培养基，37℃复苏24小时。挑取铜绿假单胞菌野生菌株单一菌落，接种于20ml3-（n-吗啉基）丙磺酸-4-吗啉丙磺酸缓冲后ph为7.0的rpmi-1640培养基中，37℃恒温摇床孵育20~24小时后，转速220~250转/分，用3-（n-吗啉基）丙磺酸-4-吗啉丙磺酸缓冲后ph为7.0的rpmi-1640培养基将上述过夜培养的菌悬液稀释至od600=0.1~0.12，并通过活菌菌落计数调整铜绿假单胞菌pao1菌液的终浓度至1~5×10ˆ8cfu/ml。

（3）体外静止烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合生物被膜模型的建立在灭菌的24细胞培养板各孔预先各放置一枚直径为13~15mm的灭菌圆形玻璃细胞爬片，再将步骤（1）制备好的烟曲霉菌孢子悬液（浓度为1×10ˆ6cfu/ml）加入24孔细胞培养板各个孔中，每孔1500ul，并于37℃恒温箱孵育至16小时后，将步骤（2）制备的铜绿假单胞菌菌悬液加入上述各孔中，每孔50ul，每组3个复孔。将两者混合均匀后于37℃再继续恒温静止培养24~48小时，烟曲霉菌孢子悬液与铜绿假单胞菌菌悬液之比为30：1。

（4）结晶紫染色法对混合生物被膜半定量检测按照步骤（1）-（3）所述方法建立烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜模型24~48小时后，用移液器枪头轻轻移除培养液体，并用灭菌pbs轻轻漂洗上述各孔3次以去除载体表面的浮游菌，并尽量用一次性2ml注射器抽吸净各孔内残余的pbs漂洗液。于各孔加入2%戊二醛溶液1ml室温固定2小时，吸净戊二醛后室温干燥，各孔加入0.5%结晶紫1ml染色15分钟，再以无菌pbs轻轻漂洗去每孔内未结合的结晶紫。移除漂洗液后室温干燥，往各孔每孔加入1ml95%乙醇溶液脱色10-15分钟，用移液器枪头反复吹打使载体表面使已结合的结晶紫充分溶解至洗脱液中，各孔吸取100µl洗脱液加入96孔板。酶标仪590nm波长测定各孔吸光度值（od595nm）。每组每次分别设置3个复孔取其平均值，实验独立重复3次。

（5）光镜下观察混合生物被膜的形态学按照步骤（1）-（3）所述方法建立烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合生物被膜模型24小时后，用移液器枪头轻轻移除培养液体，并用灭菌pbs轻轻漂洗上述各孔3次以去除载体表面的浮游菌，并尽量用一次性2ml注射器抽吸净各孔内残余的pbs漂洗液。于各孔加入2%戊二醛溶液1ml室温固定2小时。吸净戊二醛后室温干燥。各孔加入0.5%结晶紫1ml染色15分钟。再以无菌pbs轻轻漂洗去每孔内未结合的结晶紫。移除漂洗液后室温干燥。每组各取一个载体，置于正置显微镜下分别放大100和400倍观察结晶紫染色后的铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜结构。

（6）扫描电子显微镜观察烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合生物被膜超微结构按照步骤（1）-（3）所述方法建立烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合生物被膜模型24~48小时后，以无菌pbs轻轻漂洗载体表面的浮游菌3次，移液器枪头充分移除漂洗液，用灭菌眼科镊子钳小心取出各孔内玻片，将其培养液接触面朝上，置于3%戊二醛中固定2小时，30%至100%梯度酒精依次脱水，真空干燥仪干燥，离子溅射仪喷镀金粉后，于30kv电压下放大2000倍进行扫描电镜观察。

（7）以（1）和（2）中所述方法制备的单一菌悬液，分别单独于24孔板中建立24小时、48小时的烟曲霉菌单一生物被膜和铜绿假单胞菌单一生物被膜，按照（4）（6）步骤进行平行试验，作为混合菌生物被膜的平行对照。

实施例2结晶紫染色法对混合生物被膜半定量检测结果

建模后24小时，可见混合生物被膜组载体表面生物被膜形成量（od595nm:1.129±0.337）明显多于单一烟曲霉菌（od595nm:0.993±0.207）和单一铜绿假单胞菌（od595nm:0.384±0.172）生物被膜组。建模后48小时，各组载体表面生物被膜形成量进一步增加，且48小时混合生物被膜组（od595nm:1.803±0.386）载体表面生物被膜形成量仍然比单一烟曲霉菌（od595nm:1.682±0.054）和单一铜绿假单胞菌（od595nm为0.699±0.280）生物被膜组高（见图1）。

实施例3光镜下观察混合生物被膜的形态学

结晶紫染色后在正置荧光显微镜下观察烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合生物被膜的结构，可见相对于单一菌的生物被膜而言，混合菌生物被膜的结构更加致密，载体表面的生物总量更丰富，烟曲霉菌的菌丝层叠交错成网状立体结构，铜绿假单胞菌则散在的粘附于网状结构的菌丝表面（见图2）。

实施例4扫描电镜对混合生物被膜形态学观察

扫描电镜下可见单一烟曲霉菌或铜绿假单胞菌及二者混合后在体外培养24小时后均可形成典型的生物被膜结构（见图3）。烟曲霉菌-铜绿假单胞菌混合生物被膜的形态结构比单一生物被膜形态结构更为复杂。进一步增大扫描电镜的放大倍率观察可见,烟曲霉菌菌丝交错形成混合生物被膜的三维网状主干结构，铜绿假单胞菌体粘附于其表面，并被自身及烟曲霉菌分泌的胞外基质包被，形成典型的混合菌生物被膜结构（见图4）。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。