一种利用柠檬型克勒克氏酵母菌发酵甜橙果酒的方法与流程

本发明属于菌种技术领域，尤其涉及一种利用柠檬型克勒克氏酵母菌发酵甜橙果酒的方法。

背景技术：

把水果加工、酿造制成果酒是解决水果产量过剩、提高附加值的有效方法之一，这在葡萄产业做得很好，葡萄酒已经被世界广大消费者认可，在国内，也发展了类似国外的葡萄酒庄。在国外葡萄酒市场火红的时候，国内的酒类研究者，试图以其他水果来按照葡萄酒的工艺生产出相应的果酒，研究涉及的相当多，诸如苹果酒、猕猴桃酒、桃酒、沙棘酒、桑葚酒、宁夏枸杞红等果酒新品种日益发展起来了，然而，这些新产品根本无法与葡萄酒相比。而本发明中所研究的甜橙类酒，虽有报道与产品出售，但市场并不好。分析果酒行业中葡萄酒一支独大的原因，主要有以下2点：1、葡萄酒的生产已经经历了漫长的发展，无论从工艺、葡萄品种、发酵专用酵母菌等，都基本达到了协调与统一。2、葡萄酒的养生、保健价值得到广大爱好者的认可，有一大批稳定的消费群体。甜橙果酒包括其他果酒发展中存在的问题，有以下3点：1、发酵酵母菌菌种问题，每一种酒都由适宜的酵母发酵而得，正如葡萄酒有葡萄酒专用酵母、啤酒有啤酒酵母、酒精发酵有酒精酵母、黄酒发酵有黄酒酵母，每一种酒的生产换用其他酵母不是不能发酵糖分产生酒精成分，而是不能产生形成该酒独特风味的风味成分，所以，知名品牌的酒业公司把菌种视为企业的命根子，所用菌种是不可以无条件外泄的。其他果酒难于形成相当规模，扩大市场份额，重要的原因在于，这些公司无可奈何地选择了葡萄酒酵母或所谓果酒专用酵母来生产非葡萄酒，这样，所生产的果酒，不能体现自己的特色，更不能恰当地把特色水果转变成特色果酒。2、工艺问题，很多人认为生产果酒很简单，榨汁、调酸、调糖后发酵就可以了，葡萄酒工艺的成熟，经历了若干年的发展，才解决了葡萄酒生产中所发生的诸多问题。每一种水果都有其自身特点，所酿造的果酒应该具有该水果果酒特有的个性，而不能仅仅认为含有一定酒精度的水果发酵物就是该果酒。一款果酒的成型，要历经多代人的积累，解决生产中出现的问题，不断优化工艺，尽力达到一个较高的水平。3、酿酒品种问题，甜橙品种多，不是任何一个品种都适合酿造甜橙酒，这在葡萄酒行业研究的较为透彻。葡萄品种有5000多个，但能酿造葡萄酒的只有几十个品种，特殊品牌葡萄酒的酿造，每个品牌适宜的就1-2个品种。所以，甜橙果酒的酿造，品种的改良与筛选，也是该行业必须解决的问题之一，发展其他果酒品牌，也不能回避该问题。

综上所述，酿造甜橙果酒现有技术存在的问题有3个：第一个是没有筛选到酿造甜橙果酒的专用酵母菌；第二个是没有酿造甜橙果酒的独特工艺；第三个是没有筛选到酿造甜橙果酒的合适品种。本发明，首先解决了甜橙果酒酿造的第一个问题，也是最关键的问题。其次，通过漂烫技术，解决了甜橙榨汁过程中杂菌污染，引起酒味不纯净的问题，解决了甜橙果酒工艺中众多问题中的一个。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用柠檬型克勒克氏酵母菌发酵甜橙果酒的方法，以期解决甜橙果酒发酵所需要的适宜酵母菌种。

本发明是这样实现的：利用柠檬型克勒克氏酵母菌发酵甜橙果酒的方法，所述利用柠檬型克勒克氏酵母菌发酵甜橙果酒的方法把调整糖浓度和酸度的甜橙汁泵入清洁的发酵罐，加入10％的柠檬型克勒克氏酵母菌种子液，发酵温度20-22℃；每天取样检测发酵液的还原糖浓度，到发酵液中还原糖浓度为2％以下时，进入去酵母阶段。

进一步，所述甜橙汁的制备方法包括：

(1)挑选汁水浓、无霉烂、新鲜的甜橙；

(2)漂烫及去皮，0.5％稀盐酸浸泡甜橙10分钟，洁净清水冲洗干净，沸水中漂烫2-3分钟，趁热剥去果皮；

(3)榨汁及防褐变，用榨汁机压榨直到果汁榨尽为止；在压榨开始前，按照80mg/l的量加入so2；

(4)在果汁中加入0.03％的复配酶制剂，20-25℃，搅拌酶解2h；过滤得到澄清甜橙果汁。

进一步，所述柠檬型克勒克氏酵母菌的扩大培养，配制糖浓度12％的甜橙汁，加入2％的蛋白胨，118℃灭菌冷却后，按10倍放大法，得到酵母种子液；用血球计数板计数，酵母菌浓度达到10⁸cfu/ml。

进一步包括：

后发酵前，调整发酵液温度降到8-10℃，自然沉降5-7天；去掉酵母泥，将上清液转移到后发酵罐；

测试并调上清发酵液酒精度11-12°；测试并调上清发酵液so2至120mg/l防止酸败；温度18-20℃发酵约20-30天，使酵母继续发酵，直至液面平静为止；

澄清处理，在后发酵液中加入复合澄清剂，处理完毕，测试澄清度；用硅藻土过滤机过滤获得澄清酒液；

调配过滤，将不同发酵批次、品质略有差异的原酒，根据技师以及产品定位风格进行产品勾兑；合格的勾兑品，再次用硅藻土过滤机过滤，随即无菌灌装；

成品，产品贴标入库，待售。

本发明的另一目的在于提供一种由所述利用柠檬型克勒克氏酵母菌发酵甜橙果酒的方法发酵的果酒。

本发明中甜橙酒的生产用酵母来自于生长20多年的甜橙老树土壤中，分离该酵母菌时，得到的酵母菌很单一，就是柠檬型克勒克氏酵母菌，没有其他杂菌，这从土壤微生物入住的视觉看，应该是长期驯化的结果，其他不适合甜橙“气息”的微生物被淘汰了，换句话说，这株酵母菌是发酵甜橙果汁产酒的最佳酵母。本发明仅仅用水果漂烫技术减少果皮表面带来的微生物对甜橙果酒的负面作用，可以说，这也仅仅是工艺改革的其中一部分，完善的甜橙果酒工艺的形成还需要更多革新。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、柠檬型克勒克氏酵母菌比其他酵母在转化甜橙皮时，效率更高；

以该酵母为参照，比较了几种酵母对甜橙皮的分解效率，如果该酵母对甜橙皮的分解效率高，可以初步判定其更适合于用来酿造甜橙果酒，从而取代现有甜橙果酒采用其他酵母的弊端，结果如下：

表14种酵母对甜橙皮的降解率(％)

从上表可以看出，对甜橙皮降解6天后，柠檬型克勒克氏酵母菌与其他酵母比较有显著高的降解率，说明该酵母更适合于转化甜橙相关成分。

2、柠檬型克勒克氏酵母菌比其他酵母转化甜橙汁，生香更突出比较了该酵母转化甜橙果汁之后，香气成分的多样性，结果如下：

表24种酵母菌发酵产甜橙酒香气组成

分析结果表明，通用果酒酵母菌发酵的甜橙酒中共检测出20种香气成分，其中脂类物质8种，醇类物质6种，醛类物质5种，其他物质1种，其中相对含量占到1％的物质分别是苯乙醇1.03％，正戊醇10.85％，辛酸乙酯12.07％，苯甲酸异戊酯1.09％，肉桂酸乙酯3.1％，癸酸乙酯15.82％，己酸乙酯2.91％；啤酒酵母发酵的甜橙酒中共检测出18种香气成分，其中脂类物质7种，醇类物质5种，醛类物质5种，其他物质成分1种，其中相对含量占到1％的物质分别是苯乙醇1.01％，正戊醇8.41％，辛酸乙酯15.56％，2-甲基丁醛1.57％，肉桂酸乙酯5.79％，癸酸乙酯18.83％，己酸乙酯1.55％。黄酒酵母发酵的甜橙酒中共检测出香气成分18种香气成分，其中脂类物质7种，醇类物质5种，醛类物质5种，其他物质成分1种，其中相对含量占到1％的物质分别是苯乙醇1.08％，正戊醇8.79％，辛酸乙酯16.68％，2-甲基丁醛1.09％，肉桂酸乙酯1.2％，癸酸乙酯23.91％，己酸乙酯1.11％。柠檬型克勒克氏酵母发酵的甜橙酒共检测出20种香气成分，其中脂类物质9种，醇类物质7种，醛类物质3种，其他成分物质1种，其中相对含量占到1％的物质分别是乙酸乙酯1.05％，苯乙醇2.11％，正戊醇5.67％，橙花叔醇3.21％，辛酸乙酯20.62％，邻苯二甲酸二乙酯13.59％，癸酸乙酯26.69％，己酸乙酯9.89％。脂类物质大多具有花、果香气，例如癸酸乙酯具有葡萄酒的香气，辛酸乙酯具有白兰地酒香气，乙酸异戊酯具有类似于香蕉、梨水果的香味。柠檬型克勒克氏酵母发酵的甜橙酒的酯类含量和相对含量均高于三种活性干酵母，脂类物质含量为82.27％，说明柠檬型克勒克氏酵母的产脂能力明显优于三种活性干酵母，具有很好的产香能力，这对于甜橙果酒的生产具有一定的实际意义。

3、柠檬型克勒克氏酵母菌的生物学特性符合果酒酿造的要求

柠檬型克勒克氏酵母菌的最适生长温度为28℃，符合较低温度下长时间发酵酿造优质果酒的工艺要求(图2)；在ph2.5-9.0范围内均能生长，最适生长ph范围为3.2-4.2，符合果酒发酵低酸条件(ph3.6-3.8)抑制产酸细菌繁殖引起酒质酸败的要求(图3)；柠檬型克勒克氏酵母菌能耐16％酒精浓度，达到果酒要求酒精度10-12°(v/v)的要求(表4)。

本发明的柠檬型克勒克氏酵母菌用于甜橙果酒的酿造未见报道，依据上述基础资料，柠檬型克勒克氏酵母菌酿造甜橙果酒具有独特的优势，为行业首创。对甜橙采用漂烫、去皮然后榨汁的方法，有效地减少了皮上杂菌进入果汁的机会，以及使用柠檬型克勒克氏酵母菌发酵，所酿造的甜橙果酒口味更加净爽而无异味。

附图说明

图1是本发明实施例提供的利用柠檬型克勒克氏酵母菌发酵甜橙果酒的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的柠檬型克勒克氏酵母菌最适生长温度示意图。

图3是本发明实施例提供的柠檬型克勒克氏酵母菌最适生长ph示意图。

图4是本发明实施例提供的柠檬型克勒克氏酵母菌生长曲线示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

甜橙是世界性第3大水果，南充是一个盛产甜橙的地方，种植甜橙具有悠久的历史，因而，南充又称为果城。然而，甜橙的价格波动很大，经常对果农造成伤害。寻求一种自我调节机制，为果农丰收创造条件，势在必行。经过反复考虑，选择了把甜橙加工成甜橙酒，来解决果贱伤农的问题。但查阅资料后发现，报道的以柑橘类水果生产酒的研究文章很多，生产工艺几乎一致：即柑橘类→挑选、清洗→榨汁(加抗氧化剂防杂菌、防褐变)→果汁澄清及成分调整→主发酵→后发酵→澄清处理→过滤→调配→成品，所用的发酵菌种几乎都是果酒酵母。显然，问题来了，不同的水果发酵成果酒，不可能采用一致的工艺过程以及相同的酵母菌种，这样，无法体现果酒应有的特色。就柑橘果酒来讲，研究报道多，生产商家少，而且生产的产品因为没有展示柑橘类水果果酒的应有特色而市场并不好。寻找适合于酿造柑橘类果酒的酵母菌，成了发展柑橘果酒的首要任务。通常的做法，是在柑橘园土壤中去分离。找到一颗有20多年树龄的老甜橙树。从甜橙树树冠内表层下10厘米处取了些土壤，按照酵母菌分离的常规方法分离酵母菌，奇怪的是，在分离涂布的所有平板上，获得了形态完全一致的菌落。经过鉴定，完全是柠檬型克勒克氏酵母菌。接下来，对该酵母菌种在酿造甜橙果酒上是否比其他酵母特别是果酒行业经常采用的果酒酵母更具优越性进行了多方面的测试。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的利用柠檬型克勒克氏酵母菌发酵甜橙果酒的方法包括以下步骤：

s101：挑选汁水浓、无霉烂、新鲜的甜橙；

s102：漂烫及去皮，0.5％稀盐酸浸泡甜橙10分钟，洁净清水冲洗干净，沸水中漂烫2-3分钟，趁热剥去果皮；

s103：榨汁及防褐变，用榨汁机缓慢压榨直到果汁榨尽为止。在压榨开始前，预测果汁量，按照80mg/l的量加入so2防止果汁褐变以及抑制细菌的繁殖导致发酵酸败；

s104：果汁澄清及成分调整，按照果胶酶使用说明书，在果汁中加入0.03％的复配酶制剂(lallzymeex-v)，20-25℃，搅拌酶解2h。过滤得到澄清甜橙果汁。斐林试剂法测定果汁含糖量，不足的糖分部分，分两次以沸水溶解蔗糖稍冷却后添加，确保发酵完成后，发酵果酒的酒精度达到10°(v/v)以上；

s105：柠檬型克勒克氏酵母菌(1圣艳，李林辉，王建云，一株酵母菌的鉴定及初步应用，西华师范大学学报，2014，35(4):322-326.2圣艳,甜橙果酒的研制，西华师范大学硕士学位论文，2015.)的扩大培养，配制糖浓度12％的甜橙汁，加入2％的蛋白胨，118℃灭菌冷却后，按10倍放大法，得到酵母种子液。用血球计数板计数，保证酵母菌浓度达到10⁸cfu/ml；

s106：把调整糖浓度和酸度的甜橙汁泵入清洁的发酵罐，随后加入10％的柠檬型克勒克氏酵母菌种子液，控制发酵温度20-22℃。每天取样检测发酵液的还原糖浓度，到发酵液中还原糖浓度为2％以下时，进入去酵母阶段；

s107：在进入后发酵前，调整发酵液温度降到8-10℃，自然沉降5-7天。去掉酵母泥，将上清液转移到后发酵罐；

s108：测试并调上清发酵液酒精度11-12°；测试并调上清发酵液so2至120mg/l防止酸败；温度18-20℃发酵约20-30天，使酵母继续发酵，直至液面平静为止；

s109：澄清处理，在后发酵液中加入复合澄清剂，处理完毕，测试澄清度。用硅藻土过滤机过滤获得澄清酒液；

s110：调配过滤，将不同发酵批次、品质略有差异的原酒，根据技师以及产品定位风格进行产品勾兑。合格的勾兑品，再次用硅藻土过滤机过滤，随即无菌灌装；

s111：成品，产品贴标入库，待售。

下面结合实验对柠檬型克勒克氏酵母菌的生物学特性及发酵甜橙果酒的优势作进一步的描述。

1、最适生长温度测定

将柠檬型克勒克氏酵母菌接入ypd液体培养基中，分别置于24℃、28℃、32℃、36℃、40℃的培养箱中，静置培养10h，于660nm下测定培养液的od值。od值越大，则酵母处于最适生长温度下，生长越好，反之，则od值越小。

结果如图2：柠檬型克勒克氏酵母菌在28℃时其od值最大，也即其最适生长温度为28℃，在此温度下生长最为旺盛。

2、最适生长ph测定

将柠檬型克勒克氏酵母菌接入ypd液体培养基中，分别调整培养基ph为2.7、3.2、3.7、4.2、4.7、5.2、5.7，在最适温度下于恒温培养箱中静置培养10h，于660nm下测定培养液的od值，依据od值大小确定其最适生长ph。od值越大，则酵母处于最适生长ph下，生长越好，反之，则od值越小。

结果如图3：柠檬型克勒克氏酵母菌在ph值为3.2-4.2时，od值最大，也即在此范围内，该酵母菌生长旺盛，因此它的最适生长ph值为3.7-4.2。

3、生长曲线测定

将柠檬型克勒克氏酵母菌接入ypd液体培养基中，调整培养基ph值为甜橙母菌最适生长ph值，在最适生长温度下，于115r/min在摇床上振荡培养，每隔4h取培养液于660nm下测定其od值。根据od值绘制生长曲线。

结果如图4：柠檬型克勒克氏酵母菌生长比较缓慢，在4h后进入对数生长期，在20h后菌体达到稳定，因此在发酵前进行液体种子摇瓶扩大培养时，至少需要摇瓶培养20h后，才能接入发酵培养基中进行发酵。

4、耐酸碱能力测定

将ypd液体培养基用柠檬酸和naoh将ph分别调整为1.4、1.6、1.8、2.5、8.5、9.0、10，然后接入柠檬型克勒克氏酵母菌，在最适温度下于恒温培养箱中静置培养7天，检查是否有菌体生长。若有菌体生长，则在三角瓶液体培养基表面有菌醭形成，反之，则没有。

结果如表3：

表3柠檬型克勒克氏酵母菌对耐酸碱能力的测定

注：“-”代表不生长，“+”代表能生长。

由表3可知，柠檬型克勒克氏酵母菌在培养基中的最低生长ph值为2.5，最高ph值为9.0，其生长ph值范围比较广，并且对高酸性环境有着比较强的适应力，因此它可以适用于一些高酸性果汁的发酵。

4、耐酒精能力测定

在ypd液体培养基中分别加入95％的乙醇，设定乙醇浓度分别为12％、14％、16％、18％、20％、22％，摇匀后接入酵母，28℃下恒温静置培养一周，检查是否有菌体生长。若有菌体生长，则在三角瓶液体培养基表面有菌醭形成，反之，则没有。

结果如表4：

表4柠檬型克勒克氏酵母菌耐酒精能力测定结果

由表4可知，在培养基酒精浓度为12％和14％时，柠檬型克勒克氏酵母菌能生长，但当培养基酒精度为16％时就停止了生长，虽然该酵母菌耐酒精能力不是很强，但是适合低度果酒的酿制。

6、生香能力测试

6.1香气成分的提取

取100ml酒样于250ml分液漏斗中，用100、50、50ml二氯甲烷萃取三次，每次不少于8h。合并有机相，无水硫酸钠脱水干燥，浓缩至5ml，旋转蒸发浓缩至1ml，装入样品瓶中于4℃低温下保存备用。

6.2gc-ms分析

气象色谱条件：分流方式为不分流，色谱柱为db-wax(30m×0.25mm×0.25)。程序升温为40℃保持3min，以5℃/min的升温速度升至120℃，再以8℃/min的升温速度升至230℃，保持10min。载气为he，体积流量为1ml/min，进样口温度为250℃。

质谱条件：ei+电离源，电子能量为70ev，灯丝流量为0.2ma。检测器电压为350v。扫描范围为33-450amu，离子源温度为200℃。

6.3定性定量分析

未知化合物经过计算机检索同时与nistlibrary(107kcompounds)和wileylibrary(320kcompounds，version6)相匹配。利用峰面积归一化法，通过gc-ms分析结果求出不同挥发性化学组分的相对百分含量。

结果见表2。表2显示，在供试的酿造甜橙果酒的酵母中，柠檬型克勒克氏酵母菌生香能力是最好的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。