本发明涉及一株高产葡萄糖氧化酶生产工艺。
背景技术：
葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)是一种需氧脱氢酶。采用葡萄糖氧化酶可以除去食品和容器中的氧，从而有效地防止食物的变质，因此可以应用于茶叶、冰淇淋、奶粉、啤酒、果酒及其他饮料制品的包装中，具有去除葡萄糖，脱氧、杀菌的作用。
葡萄糖氧化酶传统发酵工艺存在工艺不稳定，污染高的缺陷。黑曲霉由于含有大量的葡萄糖氧化酶，目前成为葡糖氧化酶生产新工艺的首选工艺，但目前普遍存在酶活较低，因此，以发酵毕赤酵母为菌种进行诱导发酵制备高产葡糖氧化酶是该行业的主要研究方向。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一株高产葡萄糖氧化酶生产工艺，工艺合理，成本低廉，产品酶活力高，适合工业化生产。
本发明的技术解决方案是：
一株高产葡萄糖氧化酶生产工艺，其具体步骤如下：
(1)培养基组成
麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁1.0l，琼脂15.0g，ph自然；
一级种子罐培养基：葡萄糖1.5％-2.5％，蛋白胨1.5％-2.5％，酵母粉1％-1.5％；
发酵培养基：葡萄糖5％，磷酸二氢铵5％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸钾2.5％，硫酸镁1.8％，硫酸钙0.5％，氢氧化钾0.2％，微量元素l0.6％，甲醇0.05％，消泡剂0.03％；
(2)菌种培养
将发酵毕赤酵母(pichiafermentans)编号2.1838中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，用麦芽汁琼脂培养基在温度25℃-28℃下，发酵培养24h，作为一级发酵种子液；
(3)一级种子培养
将一级发酵种子液接种到发酵培养基中进行一级种子培养，接种量为3％-5％，培养温度为28℃-30℃，风量为1:2vvm，转速160rpm，培时24h，作为二级培养种子液；
(4)二级种子培养
将二级种子接种液接种到发酵培养基中进行二级种子培养，接种量为3％-5％，培养温度为28℃-30℃，风量为1:2vvm，转速为160rpm-180rpm，培养时间为48h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；
(5)发酵培养
将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为3％-5％，培养温度为28℃-30℃，0-40h溶氧＞40％，40h以后溶氧＞20％，进行诱导表达，培养时间为100h，发酵结束，收集罐内发酵液；
(6)喷雾干燥
在发酵液经过离心喷雾干燥，在170℃下喷雾干燥，制得葡萄糖氧化酶粉末。
本发明的有益效果：
以发酵毕赤酵母进行发酵制备葡萄糖氧化酶，经优化菌种活化条件，发酵工艺优化控制，确立了稳定的产业化发酵生产工艺，工艺合理，采用本方法发酵后制备的葡萄糖氧化酶活力可达2000u/g以上，大大减少了葡萄糖氧化酶的生产成本，促进规模化工业生产。
具体实施方式
实施例1
(1)培养基组成
麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁1.0l，琼脂15.0g，ph自然；
一级种子罐培养基：葡萄糖1.5％，蛋白胨2.5％，酵母粉1％；
发酵培养基：葡萄糖5％，磷酸二氢铵5％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸钾2.5％，硫酸镁1.8％，硫酸钙0.5％，氢氧化钾0.2％，微量元素l0.6％，甲醇0.05％，消泡剂0.03％；
(2)菌种培养
将发酵毕赤酵母(pichiafermentans)编号2.1838中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，用麦芽汁琼脂培养基在温度25℃下，发酵培养24h，作为一级发酵种子液；
(3)一级种子培养培养罐
将一级发酵种子液接种到60m3培养罐用发酵培养基进行一级种子培养，接种量为3％，培养温度为28℃，培养量为40m3，风量为80m3/h，转速160rpm，培时24h，作为二级培养种子液；
(4)二级种子培养
将二级种子接种液接种到60m3培养罐用发酵培养基进行二级种子培养，接种量为3％，培养温度为28℃，培养量为40m3，风量为80m3/h，转速为160rpm，培养时间为48h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；
(5)发酵培养
将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为3％，培养温度为28℃，0-40h溶氧＞40％，40h以后溶氧＞20％，进行诱导表达，培养时间为100h，发酵结束，收集罐内发酵液；
(6)喷雾干燥
在发酵液经过离心喷雾干燥，在170℃下喷雾干燥，制得葡萄糖氧化酶粉末。菌株经16srdna序列测序鉴定，确定该菌株为发酵毕赤酵母。葡萄糖氧化酶活力可达2056u/g。
实施例2
(1)培养基组成
麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁1.0l，琼脂15.0g，ph自然；
一级种子罐培养基：葡萄糖2.5％，蛋白胨1.5％，酵母粉1.5％；
发酵培养基：葡萄糖5％，磷酸二氢铵5％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸钾2.5％，硫酸镁1.8％，硫酸钙0.5％，氢氧化钾0.2％，微量元素l0.6％，甲醇0.05％，消泡剂0.03％；
(2)菌种培养
将发酵毕赤酵母(pichiafermentans)编号2.1838中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，用麦芽汁琼脂培养基在温度28℃下，发酵培养24h，作为一级发酵种子液；
(3)一级种子培养
将一级发酵种子液接种到60m3培养罐用发酵培养基进行一级种子培养，接种量为5％，培养温度为30℃，培养量为40m3，风量为80m3/h，转速160rpm，培时24h，作为二级培养种子液；
(4)二级种子培养
将二级种子接种液接种到60m3培养罐用发酵培养基进行二级种子培养，接种量为5％，培养温度为30℃，培养量为40m3，风量为80m3/h，转速为180rpm，培养时间为48h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；
(5)发酵培养
将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为5％，培养温度为30℃，0-40h溶氧＞40％，40h以后溶氧＞20％，进行诱导表达，培养时间为100h，发酵结束，收集罐内发酵液；
(6)喷雾干燥
在发酵液经过离心喷雾干燥，在170℃下喷雾干燥，制得葡萄糖氧化酶粉末。菌株经16srdna序列测序鉴定，确定该菌株为发酵毕赤酵母。葡萄糖氧化酶活力可达2069u/g。
实施例3
(1)培养基组成
麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁1.0l，琼脂15.0g，ph自然；
一级种子罐培养基：葡萄糖2.0％，蛋白胨2.0％，酵母粉1.2％；
发酵培养基：葡萄糖5％，磷酸二氢铵5％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸钾2.5％，硫酸镁1.8％，硫酸钙0.5％，氢氧化钾0.2％，微量元素l0.6％，甲醇0.05％，消泡剂0.03％；
(2)菌种培养
将发酵毕赤酵母(pichiafermentans)编号2.1838中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，用麦芽汁琼脂培养基在温度26℃下，发酵培养24h，作为一级发酵种子液；
(3)一级种子培养
将一级发酵种子液接种到60m3培养罐用发酵培养基进行一级种子培养，接种量为4％，培养温度为29℃，培养量为40m3，风量为80m3/h，转速160rpm，培时24h，作为二级培养种子液；
(4)二级种子培养
将二级种子接种液接种到60m3培养罐用发酵培养基进行二级种子培养，接种量为4％，培养温度为29℃，培养量为40m3，风量为80m3/h，转速为170rpm，培养时间为48h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；
(5)发酵培养
将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为4％，培养温度为29℃，0-40h溶氧＞40％，40h以后溶氧＞20％，进行诱导发酵，培养时间为100h，发酵结束，收集罐内发酵液；
(6)喷雾干燥
在发酵液经过离心喷雾干燥，在170℃下喷雾干燥，制得葡萄糖氧化酶粉末。菌株经16srdna序列测序鉴定，确定该菌株为发酵毕赤酵母。葡萄糖氧化酶活力可达2078u/g。
以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。