一种高产丁酸梭菌的发酵生产工艺的制作方法

本发明涉及一种高产丁酸梭菌的发酵生产工艺。

背景技术：

丁酸梭酸(clostridiumbutyricum)是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，为内生芽孢，具有很强的耐受性，能耐高温、耐酸、耐胆汁，因而通过消化道不失活，在体外室温下可保存三年以上不失效。并且对青霉素、氨苄西林、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、氯霉素等有一定的抗性，因此这种制剂可和抗生素合用，提高疗效。大量实验证明它无任何毒副作用，被广泛用于医药、功能性保健食品和动物饲料的添加剂及植物肥料。

目前，枯草芽孢杆菌的发酵培养仍停留在实验室阶段，生产成本高，不适合工化投产。而工业化生产，普遍存在产品活菌数低，产品没有市场竞争。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种高产丁酸梭菌的发酵生产工艺，该方法发酵条件合理，成本低廉，产品活菌数搞，产品质量稳定，适合工业化生产。

本发明的技术解决方案是：

一种高产丁酸梭菌的发酵生产工艺，其具体步骤如下：

1.1培养基组成

发酵培养基，1l：胰蛋白胨1％、牛肉粉膏0.3％、酵母粉0.5％、葡萄糖2％、氯化钠0.2％、乙酸钠0.2％、l-半胱氨酸盐酸盐0.05％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.02％、碳酸钙0.05％、磷酸氢二钾0.4％、水余量；

1.2菌种活化

称取gam培养基60.0g，加热溶解1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至室温，氯化血红素2.5g，脱纤维兔血70ml，卡那霉素100mg，新霉素100mg，万古霉素1mg，混匀，得到活化液；

在厌氧条件下，从菌种保存培养皿上挑取丁酸梭菌菌株至活化液中，在厌氧、30℃-37℃下培养24h-36h；

1.3一级种子培养

将制备好的丁酸梭菌活化液接种到发酵罐的发酵培养基中，接种量为1％-5％，在温度为30℃-37℃、罐压为0.05mpa-0.10mpa下进行一级种子液培养，发酵罐转速为100r/min-200r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为5.0-6.0，发酵培养10h，作为二级培养种子液；

1.4二级种子培养

将制备好的二级培养种子液接种到发酵罐的发酵培养基中，接种量为1％-5％，在温度为30℃-37℃、罐压为0.05mpa-0.10mpa下进行一级种子液培养，发酵罐转速为100r/min-200r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为5.0-6.0，发酵培养10h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；

1.5发酵培养

将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为3％-5％，发酵温度30℃-37℃，罐压为0.05mpa-0.10mpa，发酵罐转速为100r/min-200r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为5.0-6.0，发酵培养24h-36h，发酵结束后，收集罐内发酵液。

本发明的有益效果：

将丁酸梭菌经优化菌种活化，发酵工艺优化控制，确立了稳定的产业化发酵生产工艺，采用本方法发酵后可生产出发酵活菌数5.0×10⁹cfu/ml-1.0×10¹⁰cfu/ml，大大减少了丁酸梭菌的生产成本，适合工业规模化生产。

附图说明

图1-图2是本发明实施例1的菌种鉴定报告。

具体实施方式

实施例1

1.1培养基组成

发酵培养基，1l：胰蛋白胨1％、牛肉粉膏0.3％、酵母粉0.5％、葡萄糖2％、氯化钠0.2％、乙酸钠0.2％、l-半胱氨酸盐酸盐0.05％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.02％、碳酸钙0.05％、磷酸氢二钾0.4％、水余量；

1.2菌种活化

称取gam培养基60.0g，加热溶解1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至室温，氯化血红素2.5g，脱纤维兔血70ml，卡那霉素100mg，新霉素100mg，万古霉素1mg，混匀，得到活化液；

在厌氧条件下，从菌种保存培养皿上挑取丁酸梭菌菌株至活化液中，在厌氧、30℃下培养24h；

1.3一级种子培养

将制备好的丁酸梭菌活化液接种到发酵罐的发酵培养基中，接种量为1％，在温度为30℃、罐压为0.05mpa下进行一级种子液培养，发酵罐转速为100r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为5.0，发酵培养10h，作为二级培养种子液；

1.4二级种子培养

将制备好的二级培养种子液接种到发酵罐的发酵培养基中，接种量为1％，在温度为30℃、罐压为0.05mpa下进行一级种子液培养，发酵罐转速为100r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为5.0，发酵培养10h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；

1.5发酵培养

将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为3％，发酵温度30℃，罐压为0.05mpa，发酵罐转速为100r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为5.0，发酵培养24h，发酵结束后，镜检菌体全部形成芽孢，停罐，收集罐内发酵液。菌株经16srdna序列测序鉴定，确定该菌为丁酸梭菌。发酵活菌数5.0×10⁹cfu/ml。

实施例2

1.1培养基组成

发酵培养基，1l：胰蛋白胨1％、牛肉粉膏0.3％、酵母粉0.5％、葡萄糖2％、氯化钠0.2％、乙酸钠0.2％、l-半胱氨酸盐酸盐0.05％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.02％、碳酸钙0.05％、磷酸氢二钾0.4％、水余量；

1.2菌种活化

称取gam培养基60.0g，加热溶解1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至室温，氯化血红素2.5g，脱纤维兔血70ml，卡那霉素100mg，新霉素100mg，万古霉素1mg,混匀，得到活化液；

在厌氧条件下，从菌种保存培养皿上挑取丁酸梭菌菌株至活化液中，在厌氧、37℃下培养36h；

1.3一级种子培养

将制备好的丁酸梭菌活化液接种到发酵罐的发酵培养基中，接种量为5％，在温度为37℃、罐压为0.10mpa下进行一级种子液培养，发酵罐转速为200r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为6.0，发酵培养10h，作为二级培养种子液；

1.4二级种子培养

将制备好的二级培养种子液接种到发酵罐的发酵培养基中，接种量为5％，在温度为37℃、罐压为0.10mpa下进行一级种子液培养，发酵罐转速为200r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为6.0，发酵培养10h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；

1.5发酵培养

将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为5％，发酵温度37℃，罐压为0.10mpa，发酵罐转速为200r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为6.0，发酵培养36h，发酵结束后，镜检菌体全部形成芽孢，停罐，收集罐内发酵液。菌株经16srdna序列测序鉴定，确定该菌为丁酸梭菌。发酵活菌数1.0×10⁹cfu/ml。

实施例3

1.1培养基组成

发酵培养基，1l：胰蛋白胨1％、牛肉粉膏0.3％、酵母粉0.5％、葡萄糖2％、氯化钠0.2％、乙酸钠0.2％、l-半胱氨酸盐酸盐0.05％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.02％、碳酸钙0.05％、磷酸氢二钾0.4％、水余量；

1.2菌种活化

称取gam培养基60.0g，加热溶解1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至室温，氯化血红素2.5g，脱纤维兔血70ml，卡那霉素100mg，新霉素100mg，万古霉素1mg，混匀，得到活化液；

在厌氧条件下，从菌种保存培养皿上挑取丁酸梭菌菌株至活化液中，在厌氧、32下培养30h；

1.3一级种子培养

将制备好的丁酸梭菌活化液接种到发酵罐的发酵培养基中，接种量为2在温度为32罐压为0.08pa下进行一级种子液培养，发酵罐转速为120r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为5.5培养10h，作为二级培养种子液；

1.4二级种子培养

将制备好的二级培养种子液接种到发酵罐的发酵培养基中，接种量为2％，在温度为32℃、罐压为0.08mpa下进行一级种子液培养，发酵罐转速为120r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为5.5，发酵培养10h，发酵结束后，收集二级发酵种子液；

1.5发酵培养

将二级发酵种子液接种至发酵罐中，进行发酵培养，接种量为4％，发酵温度32℃，罐压为0.08mpa，发酵罐转速为120r/min，培养全程通入氮气，并控制培养环境ph值为5.5，发酵培养30h，镜检菌体全部形成芽孢，停罐，收集罐内发酵液。菌株经16srdna序列测序鉴定，确定该菌为丁酸梭菌。发酵活菌数8.0×10⁹cfu/ml。

以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。