本发明属于植物病害预防技术领域，具体涉及一种水稻褐色菌核菌粗毒素鉴定方法。
背景技术：
在水稻植株上，褐色菌核病菌通常会引起水稻的菌核杆腐病。褐色菌核病菌首次在中国台湾被描述为Sclerotium oryzae-sativae。自那时以来，该病已在许多国家报道，如意大利，印度，伊朗、委内瑞拉，智利等，最近报道的有澳大利亚。褐色菌核病菌的有性型被Gunnell和Webster称为Cerato-basidium oryzae-sativae。
水稻褐色菌核病菌呈球形，生长初期时为白色，成熟后变为棕色，病菌聚集在一起，直径可以达到0.5至2mm。水稻内产生的菌核组织，其大小从360-1250mm到270-620mm不等。水稻褐色菌核病菌在培养基上培养呈鲑肉色，蜡质，软，通常在琼脂中下沉。虽然单个菌核球状，但菌核以乌鸦脚图案的模式排列成无色块状物。一般在水稻生长季节结束时，可在叶鞘内部发现侵染的菌核。
近年来，随着大量学者对水稻纹枯病的研究更加深入，发现了从病菌中提取的毒素是引起水稻纹枯病菌的主要致病因子，同时毒素会导致水稻产生纹枯病的症状。早期的研究认为毒素是由苯乙酸和它的衍生物组成，接着又有学者指出毒素是由各种糖类的混合物组成，也有研究认为毒素是酚类混合物。水稻纹枯病菌毒素作用于水稻植株上后，水稻各组织也会在细胞膜，叶绿体等结构上表现出微小的变化。这些微小的变化会使水稻组织受到损伤，从而表现典型的症状。康霄文等通过生物学测定从而发现，水稻立枯丝核菌毒素对其胚根和胚芽具有显著的抑制作用。Vidhyasekaran等通过电导率测定得出结论：水稻纹枯病菌毒素在三种抗性的寄主中会发生电解质外渗，但毒素在低抗寄主上会产生更多渗透。这可能与不同抗性寄主的组织结构差异密切相关。此外，徐敬友等通过实验证明，不同菌株产毒能力有明显差异，菌株致病力与产生毒素毒力具有正相关性，不同寄主对毒素的敏感性也不同。由此我们可以用从病菌中提取的毒素来对遗传育种方面的抗病性做出快速鉴定。
目前对于水稻褐色菌核病菌粗毒素的研究尚未见报道，本发明是首次对水稻褐色菌核病菌粗毒素进行了提取和鉴定，该方法可有效鉴定水稻褐色菌核病菌，为水稻遗传育种方面的抗病性鉴定打下了坚实的基础。
技术实现要素：
本发明提供了一种水稻褐色菌核菌粗毒素鉴定方法。
技术问题本发明的目的是针对目前对于水稻褐色菌核病菌粗毒素的研究处于空白的现状，提供一种水稻褐色菌核菌粗毒素鉴定方法。
技术方案 本发明所提供的一种水稻褐色菌核菌粗毒素鉴定方法是通过以下步骤完成：
1)菌种的转接及培养
把保存于PDA固体斜面培养基上的水稻褐色菌核病菌转接到PDA固体培养基上，并置于设置温度为31℃恒温培养箱中培养72h。把转接好的水稻褐色菌核病菌挑2块菌丝接种到 20mL液体PDA培养液中，置于摇床上振荡培养约4-7d，温度为31℃，直至长出大量菌丝又不产生褐色菌核。
2)粗毒素的提取
把获得的菌培养液进行过滤，得到的滤液分别在60℃下进行旋转蒸发直至滤液到达原体积的1/10，接着再加入等量体积甲醇。静置2h后，以4500r/min在离心机中进行离心去沉淀，然后60℃旋转蒸发去甲醇。将获得的水相加入等体积的乙醚进行萃取，重复3次，合并3次的乙醚萃取相，在旋转蒸发仪上45℃进行旋转蒸发去除乙醚，获得的浆状物加水定容至1mL 即为粗毒素。
3)粗毒素的致病性鉴定
取水稻品种为金刚30的水稻叶片，在叶片同一部位剪掉尖端组织和叶基部，保留叶中部 (4cm～5cm)的组织，放入铺有三层滤纸(直径90mm)的培养皿中，加入15mL灭菌蒸馏水保湿，在叶片上用牙签刺形成伤口，加5μL粗毒素，以空白培养基为对照，置于光照培养箱中，温度为28℃，设置光照黑暗各12h，每个处理重复3次，7d后观察病斑。
4)粗毒素的组分鉴定
将提取出的粗毒素溶于无水乙醚中，定溶至1mL。提取物用气质联用仪进行结构分析。气相色谱条件：色谱柱为TG-5MS(30mm×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱；载气为高纯氦气(纯度99.999％)；载气流速为1mL/min；采用不分流进样；进样口温度为280℃；程序升温：初始温度32℃保持1min，然后以10℃/min升到280℃，保持3min。
质谱条件：离子源为EI源，传输线温度：280℃；离子源温度：300℃；电子能量：70eV；扫描范围(m/z)：33-800amu，采用全扫描采集模式。
附图说明
图1为水稻褐色菌核病菌在PDA平板培养基上菌落形态图：
图2为水稻褐色菌核病菌粗毒素在水稻叶片上的致病性鉴定：
图3为水稻褐色菌核病菌粗毒素气质联用图。
具体实施方式
1)菌种的转接及培养
把保存于PDA固体斜面培养基上的水稻褐色菌核病菌转接到PDA固体培养基上，并置于设置温度为31℃恒温培养箱中培养96h。培养结果如图1。可以观察到病菌先形成白色菌丝，逐渐长满整个平板而后形成浅褐色菌核，界限明显，呈环形，并向外层扩展。把转接好的水稻褐色菌核病菌挑2块菌丝接种到20mL液体PDA培养液中，置于摇床上振荡培养约7d，温度为31℃，直至长出大量菌丝又不产生褐色菌核。
2)粗毒素的提取
将水稻褐色菌核病菌的培养液用单层滤纸过滤后，得到的滤液分别在60℃下进行旋转蒸发直至滤液到达原体积的1/10，接着再加入等量体积甲醇。静置2h后，以4500r/min在离心机中进行离心去沉淀，然后60℃旋转蒸发去甲醇。将获得的水相加入等体积的乙醚进行萃取，重复3次，合并3次的乙醚萃取相，在旋转蒸发仪上45℃进行旋转蒸发去除乙醚，获得的浆状物加水定容至1mL即为粗毒素。
3)粗毒素的致病性鉴定
将上述提取的粗毒素，滴加5μL在金刚30的水稻叶片伤口，4-7d后观察。从图2可以看出，病菌粗毒素对水稻叶片有致病力，叶片接种后均产生暗绿色水浸状边缘和模糊小斑，后渐扩大呈椭圆形或云纹形，边缘褪黄的症状。
4)粗毒素的组分鉴定
将提取出的粗毒素溶于无水乙醚中，定溶至1mL。提取物用气质联用仪进行结构分析。获得了样品的总离子图(图3)。通过质谱分析，从质谱图数据库中进行检索，鉴定得到26 种成分。样品中主要吸收峰的成分有下列几种，其组成成分包括醇类，酯类，酸类，醛类，烷烃类和酮类等。其中2-乙氧基-丙烷，2，3-二甲基环氧乙烷，十二烷基邻苯二甲酸酯，1-十八烷磺酰氯和2，4-(1，1-二甲基乙基)-苯酚在该菌中属特有组合成分，可作为鉴定水稻褐色菌核病菌粗毒素特征物质。
本发明首次用乙醚对水稻褐色菌核病菌粗毒素进行提取，并采用气相色谱对粗毒素进行了物质组分分析。结果表明，用该方法提取的水稻褐色菌核病菌粗毒素可引起水稻病斑产生，表明其具有生物活性。这为今后研究水稻褐色菌核病菌粗毒素提供了较为可靠简便的方法。同时，粗毒素组成成分的鉴定也为进一步研究其致病机理打下了坚实的基础，为今后植物抗病育种的研究提供了理论指导。