本发明涉及微生物
技术领域：
，更具体的说涉及一种利用红发夫酵母进行固态发酵生产虾青素的方法。
背景技术：
：虾青素是一种类胡萝卜素的含氧衍生物，属于酮式类胡萝卜素。虾青素具有超强的抗氧化活性，其抗氧化活性比β-胡萝卜素高10倍，比维生素e高500倍，并且虾青素能提高免疫力，预防肿瘤、心血管疾病以及眼部疾病等的发生。虾青素在食品、医药和化妆品等领域有广阔的应用前景，因此虾青素的市场需求量非常大，经济价值非常的高。目前，虾青素的来源有生物提取和化学合成。化学合成的虾青素在结构，功能和安全性方面与天然虾青素方面截然不同，因此美国fda已经明文禁止化学合成的虾青素进入保健品市场。天然虾青素具有安全、无公害和无残留等优点，已被多数国家批准适用于医药、食品和饲料等工业领域。天然虾青素的主要生产方法为在雨声红球藻和红发夫酵母(phaffiarhodozyma)中提取。虾青素在雨声红球藻细胞中的含量较高，能达到细胞干重的1％～3％，然而，雨声红球藻生长缓慢，培养条件也苛刻，使虾青素的生产成本较高。红发夫酵母中的虾青素含量虽然较低，约占细胞干重的0.1％～0.3％，但是红发夫酵母具有生长快速，培养条件较为粗放的优点。液体发酵技术具有原料来源广泛、生长快速以及便宜虾青素提取等优点，适合红发夫酵母的规模化培养。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本发明另一个目的就是提供一种发酵时间短，虾青素累积效率高的红发夫酵母培养方法的方法。为了实现本发明的这些目的和其他优点，提供一种提高红发夫酵母中虾青素含量的方法，其包括以下步骤：1)将虾蟹下脚料进行研磨粉碎得到磨浆液，往所述磨浆液中添加醋酸溶液处理60～80min后调节ph至7～8，添加复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，获得酶解液；往酶解液中添加硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸汽灭菌后得到发酵基质；2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养45～50小时后添加所述发酵基质，持续搅拌培养40～45小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2～3:1～2:0.03～0.05，通气量即每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比为0.2～0.4v/(v·min),继续培养45～50小时，收集菌体，即可获得虾青素含量较高的红发夫酵母。优选的是，研磨粉碎的目数≥300目。虾蟹下脚料经过研磨粉碎，有利于后续的酶解以及红发夫酵母对其的利用。优选的是，复合蛋白酶与碱性蛋白酶的质量比例为3～4:1。虾蟹下脚料经过复合蛋白酶与碱性蛋白酶的水解，得到含量丰富的小分子多肽，对红发夫酵母的生长具有促进作用，使短时间内能得到大量的红发夫酵母细胞。优选的是，所述的酶解时间为60～80min，酶解温度为45～50℃。经过上述酶解处理，得到的多肽主要为5～10个氨基酸，适合红发夫酵母的生长吸收。优选的是，酶解液、硫酸铵与糖蜜的质量比例为1～2:0.1～0.2:2～4。优选的是，所述的活化培养基包括以下组分：葡萄糖8～10g/l,酵母膏2～3g/l，蛋白胨4～5g/l，麦芽汁2～3g/l；调节ph至5.5～6.5。优选的是，所述扩大培养基的制备方法为将肉桂醛0.01～0.05g，糖蜜3～4g，葡萄糖4～5g,酵母膏2～3g，蛋白胨4～5g以及麦芽汁2～3g溶解于1l的水中调节ph至4.5～5.5，即可获得所述扩大培养基。肉桂醛能高效特异性的抑制红发夫酵母中八氢番茄红素脱氢酶的活性，使红发夫酵母累积虾青素的含量提高47％以上。优选的是，所述收集的方法为离心收集。本发明的有益效果：虾蟹下脚料经过研磨粉碎后，经过复合蛋白酶和碱性蛋白酶的水解，形成分子量丰富的多肽化合物，能促进红发夫酵母的生长，使单位时间的红发夫酵母的生长速率提高12％以上；虾蟹下脚料中不仅富含有氨基酸和蛋白质，还含有大量的虾青素，使用虾蟹下脚料作为培养基质，能促进红发夫酵母累积虾青素，使红发夫酵母中的虾青素含量提高32％以上；在红发夫酵母的后期通入混合气体，通过提高通入气体中二氧化碳的体积分数，抑制红发夫酵母的氧化呼吸作用，提高红发夫酵母中碳含量，从而促进红发夫酵母累积虾青素；红发夫酵母中的β-胡萝卜素的两种环化酶均由crtyb基因编码合成，crtyb基因过渡表达可使β-胡萝卜素和海胆酮得到累积，通入乙烯使crtyb基因的表达量提高了5倍以上。本发明方法培养的红发夫酵母中的虾青素含量占红发夫酵母干重的1.2％以上，反式结构的虾青素含量占90％以上。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例1一种提高红发夫酵母中虾青素含量的方法提高红发夫酵母中虾青素含量的方法，其包括以下步骤：1)将虾蟹下脚料进行研磨粉碎得到磨浆液，往所述磨浆液中添加质量分数为10％醋酸溶液处理60min后调节ph至5.5，添加复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，获得酶解液；往酶解液中添加硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸汽灭菌后得到发酵基质；2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后添加所述发酵基质，持续搅拌培养40小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比即通气量为0.4v/(v·min),继续培养45小时，收集菌体，即可获得虾青素含量较高的红发夫酵母。实施例2一种提高红发夫酵母中虾青素含量的方法，其包括以下步骤：1)将虾蟹下脚料进行300目研磨粉碎得到磨浆液，往所述磨浆液中添加质量分数为15％醋酸溶液处理60min后调节ph至6，添加复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，获得酶解液；往酶解液中添加硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸汽灭菌后得到发酵基质；2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养45小时后添加所述发酵基质，持续搅拌培养40小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为3:2:0.05，通气量即每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比为0.2v/(v·min),继续培养45小时，收集菌体，即可获得虾青素含量较高的红发夫酵母。实施例3一种提高红发夫酵母中虾青素含量的方法，其包括以下步骤：1)将虾蟹下脚料进行400目研磨粉碎，添加质量分数为12％醋酸溶液处理80min后调节ph至6.5，添加质量比为3:1的复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，获得酶解液；往酶解液中添加硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸汽灭菌后得到发酵基质；2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后添加所述发酵基质，持续搅拌培养40小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:2:0.05，通气量即每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比为0.3v/(v·min),继续培养45小时，收集菌体，即可获得虾青素含量较高的红发夫酵母。实施例4一种提高红发夫酵母中虾青素含量的方法，其包括以下步骤：1)将虾蟹下脚料进行300目研磨粉碎得到磨浆液，往所述磨浆液中添加质量分数为15％醋酸溶液处理60min后调节ph至7.5，添加质量比为4:1的复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，酶解时间为60min，酶解温度为50℃，获得酶解液；往酶解液中添加硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸汽灭菌后得到发酵基质；2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后添加所述发酵基质，持续搅拌培养40小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:2:0.05，通气量即每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比为0.3v/(v·min),继续培养45小时，收集菌体，即可获得虾青素含量较高的红发夫酵母。实施例5一种提高红发夫酵母中虾青素含量的方法，其包括以下步骤：1)将虾蟹下脚料进行300目研磨粉碎得到磨浆液，往所述磨浆液中添加质量分数为15％醋酸溶液处理60min后调节ph至6.5，添加质量比为4:1的复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，酶解时间为60min，酶解温度为50℃，获得酶解液；往酶解液中添加硫酸铵与糖蜜，酶解液、硫酸铵与糖蜜的质量比例为1:1:4，混合均匀，高压蒸汽灭菌后得到发酵基质；2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后添加所述发酵基质，持续搅拌培养40小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:2:0.05，通气量即每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比为0.3v/(v·min),继续培养45小时，收集菌体，即可获得虾青素含量较高的红发夫酵母。实施例6一种提高红发夫酵母中虾青素含量的方法，其包括以下步骤：1)将虾蟹下脚料进行300目研磨粉碎得到磨浆液，往所述磨浆液中添加质量分数为15％醋酸溶液处理60min后调节ph至5.5，添加质量比为4:1的复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，酶解时间为60min，酶解温度为50℃，获得酶解液；往酶解液中添加硫酸铵与糖蜜，酶解液、硫酸铵与糖蜜的质量比例为1:0.1:4，混合均匀，高压蒸汽灭菌后得到发酵基质；2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后添加所述发酵基质，持续搅拌培养40小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:2:0.05，每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比即通气量为0.3v/(v·min),继续培养45小时，收集菌体，即可获得虾青素含量较高的红发夫酵母。实施例7一种提高红发夫酵母中虾青素含量的方法，其包括以下步骤：1)将虾蟹下脚料进行300目研磨粉碎得到磨浆液，往所述磨浆液中添加质量分数为15％醋酸溶液处理60min后调节ph至5.5，添加质量比为4:1的复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，酶解时间为60min，酶解温度为50℃，获得酶解液；往酶解液中添加长度为10mm的硫酸铵与糖蜜，酶解液、硫酸铵与糖蜜的质量比例为1:0.1:2，混合均匀，高压蒸汽灭菌后得到发酵基质；2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，其中活化培养基的配置方法为将糖蜜3g，葡萄糖5g,酵母膏3g，蛋白胨5g以及麦芽汁3g溶解至1l水中，调节ph至5；在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后添加所述发酵基质，持续搅拌培养40小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:2:0.05，每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比即通气量为0.3v/(v·min),继续培养45小时，收集菌体，即可获得虾青素含量较高的红发夫酵母。实施例8一种提高红发夫酵母中虾青素含量的方法，其包括以下步骤：1)将虾蟹下脚料进行300目研磨粉碎得到磨浆液，往所述磨浆液中添加质量分数为15％醋酸溶液处理60min后调节ph至5.5，添加质量比为4:1的复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解，酶解时间为60min，酶解温度为50℃，获得酶解液；往酶解液中添加硫酸铵与糖蜜，酶解液、硫酸铵与糖蜜的质量比例为1:0.2:3，混合均匀，高压蒸汽灭菌后得到发酵基质；2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，其中扩大培养基的配置方法为肉桂醛0.01g，将糖蜜3g，葡萄糖5g,酵母膏3g，蛋白胨5g以及麦芽汁3g溶解于1l水中，调节ph至5；在搅拌条件下培养50小时后添加所述发酵基质，持续搅拌培养40小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:2:0.05，通气量即每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比为0.3v/(v·min),继续培养45小时，离心收集菌体，即可获得虾青素含量较高的红发夫酵母。与未通入乙烯的试验相比，本实施例中的crtyb基因的表达量增加了5.5倍；培养结束后检测虾青素含量，虾青素含量占酵母干重的1.79％，反式结构的虾青素占总虾青素含量的95.8％。与未添加肉桂醛的试验相比，本实施例中的八氢番茄红素脱氢酶的活性下降了86.7％，虾青素的含量提高了57.5％。实施例9对比试验1，与实施例8的操作方法相同，不同之处在于：虾蟹下脚料的酶解液使用蛋白胨或酵母膏替代。对比试验2，与实施例8的操作方法相同，不同之处在于：通入的混合气体为体积分数比为2:0.05的氧气与乙烯。对比试验3，与实施例8的操作方法相同，不同之处在于：通入的混合气体为体积分数比为2:2的二氧化碳与氧气。培养结束后分别检测红发夫酵母中的虾青素含量，单位体积培养基质的红发夫酵母的生物量，结果如下表所示。对比试验1对比试验2对比试验3实施例8虾青素(mg/g)13.514.36.117.91生物量(mg/cm3)19.531.6.930.931.4由上述试验结果可知，实施例8的红发夫酵母的生物量比对比试验1中的生物量提高了61％，实施例8的红发夫酵母中的虾青素含量比对比试验1中的虾青素含量提高了32.7％，说明通过添加虾蟹下脚料的酶解液能提高单位体积发酵基质中红发夫酵母的生物量以及红发夫酵母中的虾青素含量；实施例8与对比试验2相比，红发夫酵母中的虾青素含提高了25.2％，说明以通入提高发酵培养液中的二氧化碳含量能促进红发夫酵母中虾青素的累积；实施例8与对比试验3相比，红发夫酵母中的虾青素含提高了193％，说明乙烯能有效促进了红发夫酵母累积虾青素。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。当前第1页12