本发明涉及微生物技术领域，更具体的说涉及一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法。
背景技术：
虾青素是一种类胡萝卜素的含氧衍生物，属于酮式类胡萝卜素。虾青素具有超强的抗氧化活性，其抗氧化活性比β-胡萝卜素高10倍，比维生素e高500倍，并且虾青素能提高免疫力，预防肿瘤、心血管疾病以及眼部疾病等的发生。虾青素在食品、医药和化妆品等领域有广阔的应用前景，因此虾青素的市场需求量非常大，经济价值非常的高。
目前，虾青素的来源有生物提取和化学合成。化学合成的虾青素在结构，功能和安全性方面与天然虾青素方面截然不同，因此美国fda已经明文禁止化学合成的虾青素进入保健品市场。天然虾青素具有安全、无公害和无残留等优点，已被多数国家批准适用于医药、食品和饲料等工业领域。天然虾青素的主要生产方法为在雨声红球藻和红发夫酵母(phaffiarhodozyma)中提取。虾青素在雨声红球藻细胞中的含量较高，能达到细胞干重的1％～3％，然而，雨声红球藻生长缓慢，培养条件也苛刻，使虾青素的生产成本较高。红发夫酵母中的虾青素含量虽然较低，约占细胞干重的0.1％～0.3％，但是红发夫酵母具有生长快速，培养条件较为粗放的优点，因此通过发酵培养控制提高单位质量发酵基质的红发夫酵母的生物量和红发夫酵母细胞中的虾青素含量将能大大降低虾青素的生产成本。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明另一个目的就是提供一种虾青素含量较高、提取简便的生产虾青素的方法。
为了实现本发明的这些目的和其他优点，提供一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料进行研磨粉碎得到磨浆液，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，获得酶解液；往酶解液中添加秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养45～50小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养45～50小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为1～2:0.5～1:0.01～0.03，，通气量即每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比为0.2～0.5v/(v·min),继续培养45～50小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以体积分数为2.5％～5％的甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
优选的是，研磨粉碎得到磨浆液的目数≥300目。虾下脚料经过研磨粉碎得到磨浆液，有利于后续的酶解以及红发夫酵母对其的利用。
优选的是，复合蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比例为3～4:1。虾下脚料经过复合蛋白酶与木瓜蛋白酶的水解，得到含量丰富的小分子多肽，对红发夫酵母的生长具有促进作用，使短时间内能得到大量的红发夫酵母细胞。
优选的是，所述的酶解ph为6～7，酶解时间为60～80min，酶解温度为45～50℃。经过上述酶解处理，得到的多肽主要为5～10个氨基酸，适合红发夫酵母的生长吸收。
优选的是，酶解液、秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜的质量比例为1～2:1～2:0.2～0.4：1～2。
优选的是，所述秸秆纤维素干物质的长度为1～20mm。
优选的是，所述的活化培养基的配置方法为将葡萄糖8～10g,酵母膏2～3g，蛋白胨4～5g以及麦芽汁2～3g溶于1l水中，调节ph至5.5～6.5。
优选的是，所述扩大培养基的制备方法为将肉桂醛0.01～0.05g，糖蜜3～4g，葡萄糖4～5g,酵母膏2～3g，蛋白胨4～5g以及麦芽汁2～3g溶解于1l的水中调节ph至4.5～5.5，即可获得所述扩大培养基。肉桂醛能高效特异性的抑制红发夫酵母中八氢番茄红素脱氢酶的活性，使红发夫酵母累积虾青素的含量提高47％以上。
优选的是，所述超临界二氧化碳萃取的温度为41～43℃，萃取压力为38～42mpa，萃取时间为30～50min。在该条件下对虾青素进行超临界二氧化碳萃取时，以甲醇为夹带剂，具有萃取效率高，对虾青素具有一定的选择性萃取作用，虾青素粗提物中虾青素含量为67％以上。
本发明的有益效果：虾下脚料经过研磨粉碎得到磨浆液后，经过复合蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解，形成分子量丰富的多肽化合物，能促进红发夫酵母的生长，使单位时间的红发夫酵母的生长速率提高12％以上；虾下脚料中不仅富含有氨基酸和蛋白质，还含有大量的虾青素，使用虾下脚料作为培养基质，能促进红发夫酵母累积虾青素，使红发夫酵母中的虾青素含量提高32％以上；以秸秆干物质为基质进行固体发酵培养，能使单位体积的红发夫酵母的生物量提高79％以上；在红发夫酵母的后期通入混合气体，通过提高通入气体中二氧化碳的体积分数，抑制红发夫酵母的氧化呼吸作用，提高红发夫酵母中碳含量，从而促进红发夫酵母累积虾青素；红发夫酵母中的β-胡萝卜素的两种环化酶均由crtyb基因编码合成，crtyb基因过渡表达可使β-胡萝卜素和海胆酮得到累积，通入乙烯使crtyb基因的表达量提高了5倍以上。本发明方法培养的红发夫酵母中的虾青素含量占红发夫酵母干重的1.2％以上，反式结构的虾青素含量占90％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料进行研磨粉碎得到磨浆液，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，获得酶解液；往酶解液中添加秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养50小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，通气量为0.2v/(v·min),继续培养50小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以体积分数为2.5％的甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
实施例2
一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料使用胶体磨进行300目研磨，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，获得酶解液；往酶解液中添加秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养45小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养45小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，通气量为0.2v/(v·min),继续培养45小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以体积分数为5％的甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
实施例3
一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料使用胶体磨进行300目研磨，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加质量比例为3:1的复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，获得酶解液；往酶解液中添加秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养45小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养45小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，通气量为0.2v/(v·min),继续培养45小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
实施例4
一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料使用胶体磨进行300目研磨得到磨浆液，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加质量比例为4:1的复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，酶解ph为6，酶解时间为60min，酶解温度为50℃，获得酶解液；往酶解液中添加秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养45小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养50小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，通气量为0.2v/(v·min),继续培养50小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
实施例5
一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料使用胶体磨进行300目研磨得到磨浆液，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加质量比例为4:1的复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，酶解ph为6.5，酶解时间为80min，酶解温度为45℃，获得酶解液；往酶解液中添加秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养50小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，通气量为0.2v/(v·min),继续培养50小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
实施例6
一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料使用胶体磨进行300目研磨得到磨浆液，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加质量比例为4:1的复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，酶解ph为6，酶解时间为80min，酶解温度为45℃，获得酶解液；往酶解液中添加长度为10mm的秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，酶解液、秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜的质量比例为1:1:0.4：1，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养50小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，通气量为0.2v/(v·min),继续培养50小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
实施例7
一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料使用胶体磨进行300目研磨得到磨浆液，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加质量比例为4:1的复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，酶解ph为6，酶解时间为80min，酶解温度为45℃，获得酶解液；往酶解液中添加长度为10mm的秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，酶解液、秸秆纤维素干物质与糖蜜的质量比例为1:1:0.4，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，其中活化培养基配置方法为将葡萄糖10g,酵母膏3g，蛋白胨5g以及麦芽汁3g溶解至1l的水，调节ph至6；在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，在搅拌条件下培养50小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养50小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，通气量为0.2v/(v·min),继续培养50小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
实施例8
一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料使用胶体磨进行300目研磨得到磨浆液，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加质量比例为4:1的复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，酶解ph为6，酶解时间为80min，酶解温度为45℃，获得酶解液；往酶解液中添加长度为10mm的秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，酶解液、秸秆纤维素干物质与糖蜜的质量比例为1:1:0.4，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，其中扩大培养基的配置方法为将糖蜜3g，葡萄糖5g,酵母膏3g，蛋白胨5g以及麦芽汁3g溶解至1l水中，调节ph至5；在搅拌条件下培养50小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养50小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，通气量为0.2v/(v·min),继续培养50小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
实施例9
一种利用红发夫酵母生产虾青素的方法，其包括以下步骤：
1)将虾下脚料使用胶体磨进行300目研磨得到磨浆液，将所述磨浆液煮沸并冷却后添加质量比例为4:1的复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，酶解ph为5.5，酶解时间为80min，酶解温度为45℃，获得酶解液；往酶解液中添加长度为10mm的秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜，酶解液、秸秆纤维素干物质、硫酸铵与糖蜜的质量比例为1:1:0.4：2，混合均匀，高压蒸气灭菌后得到发酵基质；
2)将红发夫酵母接种于活化培养基中，在摇床中震荡培养，获得活化红发夫酵母；
3)将所述活化红发夫酵母接种于扩大培养基中，其中扩大培养基的配置方法为将糖蜜3g，葡萄糖5g,酵母膏3g，蛋白胨5g以及麦芽汁3g溶解于1l水中，调节ph至5；在搅拌条件下培养45小时后与所述发酵基质混合，通入无菌氧气持续培养50小时，通入无菌二氧化碳、氧气与乙烯组成的混合气体，二氧化碳、氧气与乙烯的体积分数比为2:1:0.03，通气量为0.2v/(v·min),继续培养45小时，获得虾青素含量较高的红发夫酵母；
4)将经过步骤3)培养获得的红发夫酵母置于萃取釜中，以甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳萃取，萃取的温度为41℃，萃取压力为38mpa，萃取时间为30min，得到的萃取液为虾青素粗提物，将所述虾青素粗提物提纯即得到虾青素。
与未通入乙烯的试验相比，crtyb基因的表达量增加了5.5倍；培养结束后检测虾青素含量，虾青素含量占酵母干重的1.31％，反式结构的虾青素占总虾青素含量的95.8％。与未添加肉桂醛的试验相比，本实施例中的八氢番茄红素脱氢酶的活性下降了86.7％，虾青素的含量提高了57.5％。
实施例10
对比试验1，与实施例9的操作方法相同，不同之处在于：不添加秸秆纤维素干物质，酶解液与糖蜜和硫酸铵混合均匀后进行液体发酵。
对比试验2，与实施例9的操作方法相同，不同之处在于：虾下脚料的酶解液使用蛋白胨或酵母膏替代。
对比试验3，与实施例9的操作方法相同，不同之处在于：通入的混合气体为体积分数比为2:1的二氧化碳与氧气。
培养结束后分别检测红发夫酵母中的虾青素含量，单位体积培养基质的红发夫酵母的生物量，结果如下表所示。
由上述试验结果可知，实施例9的红发夫酵母的生物量比对比试验1中的生物量提高了79.6％，说明通过添加秸秆纤维素干物质能提高单位体积发酵基质中红发夫酵母的生物量；实施例9与对比试验2相比，红发夫酵母中的虾青素含提高了32.7％，说明以虾下脚料的酶解液为培养基质能促进红发夫酵母中虾青素的累积；实施例9与对比试验3相比，红发夫酵母中的虾青素含提高了113％，说明乙烯能有效促进了红发夫酵母累积虾青素。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。