本发明涉及一种苯甲酰胺衍生物的制备方法及其应用。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病、多发病，且随人类生活水平提高，其发病率日趋上升态势，为了治疗癌症，人们已经做了大量的努力来研制各种类型的抗肿瘤药。近年来人们对hdac靶点的研究日益增多，其中比较典型的hdacis上市药物有伏立诺他(saha)与贝利司他，在调查口服治疗或静脉注射治疗对晚期白血病和实体瘤的抗癌活性、药物动力学性质和药物稳定性的临床ⅰ期试验中，saha表现出较为理想的抗癌活性，但也有相当的毒副作用，这可能与其异羟肟酸结构的不稳定性有关，同时其还存在亚型选择性低的缺点。寻找一种高效、低毒、化学结构稳定的新型hdacis抗肿瘤药是当前的课题之一。
技术实现要素：
本发明公开一种苯甲酰胺衍生物类化合物，同时公开这种化合物的制备方法及用途。
本发明的苯甲酰胺衍生物类化合物，其化学式如式ⅰ所示：
其中，取代基r1为氢、氟、氯、溴、碘、甲基、三氟甲基、n,n-二甲氨基或苯基中的任何一个；取代基r2为氢或甲基中的任何一个。
本发明公开的苯甲酰胺衍生物类化合物通过反应式ii所示方法制备：
本专利合成的苯甲酰胺衍生物hdaci旨在提高传统组蛋白去乙酰化酶锌离子的螯合稳定性，以期获得组蛋白去乙酰化酶抑制作用更强，选择性更强的hdaci，本发明的化合物可在抗肿瘤药物的制备中应用，可以增大hdaci对部分肿瘤细胞的选择性，同时减少细胞毒性。
具体实施方式
一、本发明化合物的制备及表征
本发明化合物的具体制备方法参见反应式ⅲ：
由式ⅲ可知，当先用不同的取代苯甲酸及不同的胺，可得到不同的15种目标化合物，这些化合物的制备如下所述：
ⅰ.称取取代苯甲酸(6mmol)溶于1,4-二氧六环20ml中，后加入n-羟基丁二酰亚胺(nhs)0.83g(7.2mmol)，后称取n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)1.50g(7.2mmol)溶于适量1,4-二氧六环，将此溶液缓慢滴加到上述反应液中常温条件下搅拌6h，期间产生浑浊的白色沉淀(dcu)，反应结束后抽滤除去白色沉淀，留取滤液待用，滤液为淡黄色澄清液体。
ⅱ.称取碳酸氢钠1.00g(12mmol)溶于适量水中，称取6-氨基己酸0.79g(6mmol)溶于上述碳酸氢钠溶液，充分溶解后将此溶液缓慢滴加至ⅰ步骤中留取待用的滤液中，50℃下搅拌24h。反应完成后产生少量白色不溶沉淀，抽滤除去沉淀留取滤液，滤液减压蒸除大部分溶剂，剩余物加入水40ml，超声下震摇均匀，用乙酸乙酯(30ml×2)洗滤液，水层用浓盐酸酸化至ph＝3，搅拌10分钟后溶液底部产生黄色油状物，后用乙酸乙酯(30ml×2)萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯后抽滤，后将乙酸乙酯减压蒸除浓缩，得到粗产物中间体。
ⅲ.将上述中间体约5mmol溶于25ml无水四氢呋喃(thf)中，称取0.58g(5mmol)nhs溶于上述溶液中冰浴条件下搅拌，随后称取1.14g(5.5mmol)的dcc加入反应液，0℃条件下搅拌5min，后于室温条件下搅拌反应6h，期间产生浑浊白色沉淀(dcu)，反应结束抽滤除去白色沉淀，滤液减压浓缩，剩余物为产生的活性酯，留取备用。
ⅳ.上述活性酯溶于25ml无水thf中，置于冰浴中，向内滴加乙醇胺0.31g(5mmol)/2-羟基丙胺0.38g(5mmol)滴加完毕于常温下搅拌反应16h，有白色浑浊固体产生，减压除去四氢呋喃，剩余物用无水甲醇溶解，抽滤，不溶部分弃掉，留取滤液，进行柱层析纯化分离(展开剂：氯仿：乙酸乙酯：甲醇＝4:4:1～4:6:1)，最终可得到15种目标化合物，即化合物e1，化合物e2，……，化合物e15。
本发明的15种目标化合物的结构、产率、性状及谱图数据如下：
n-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-6-oxohexyl)benzamide(e1):灰白色粉末；yield:41％；mp：111.2-114.5℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.40(t,1h,j＝6.0hz,-arconh-),7.80-7.77(m,2h,ar-h2,ar-h6),7.73(t,1h,j＝4.0hz,-conh-),7.49-7.39(m,3h,ar-h3,ar-h4,ar-h5),4.60(t,1h,j＝4.0hz,-oh),3.35-3.30(dd,2h,j1＝8.0hz,j2＝12.0hz,-ch2oh),3.22-3.17(dd,2h,j1＝8.0hz,j2＝12.0hz,-ch2nh-),3.07-3.03(dd,2h,j1＝4.0hz,j2＝12.0hz,-ch2nh-),2.03(t,2h,j＝6.0hz,-ch2co-),1.50-1.43(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.27-1.19(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.66,166.53,135.19,131.43,128.68,127.58,60.44,41.86,39.77,35.78,29.41,26.67,25.52.esi-ms:calcdforc15h22n2o3[m+h]+279.1630,found279.1744.。
4-(dimethylamino)-n-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-6-oxohexyl)benzamide(e2):淡黄色固体粉末；yield:42％；mp：120.4-122.3℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.01(t,1h,j＝5.6hz,-arconh-),7.70(t,1h,j＝5.6hz,-conh-),7.67-7.65(m,2h,ar-h2,ar-h6),6.66-6.63(m,2h,ar-h3,ar-h5),4.58(t,1h,j＝5.4hz,-oh),3.35-3.31(dd,2h,j1＝6.0hz,j2＝12.0hz,-ch2oh),3.18-3.13(dd,2h,j1＝6.8hz,j2＝12.8hz,-ch2nh-),3.07-3.03(dd,2h,j1＝6.0hz,j2＝12.0hz,-ch2nh-),2.91(s,6h,-n(ch3)2),2.02(t,2h,j＝7.2hz,-ch2co-),1.50-1.40(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.25-1.18(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.68,167.70,154.51,130.23,123.71,111.29,60.29,41.56,41.43,41.73,39.78,36.45,29.61,25.56,25.41.esi-ms:calcdforc17h27n3o3[m+h]+322.2052,found322.2136.。
4-chloro-n-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-6-oxohexyl)benzamide(e3):灰白色粉末；yield:43％；mp：112.4-115.9℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.52(t,1h,j＝5.6hz,-arconh-),7.85(d,2h,j＝8.0hz,ar-h2,ar-h6),7.77(t,1h,j＝5.2hz,-conh-),7.53(d,2h,j＝8.0hz,ar-h3,ar-h5),4.64(s,1h,-oh),3.38-3.33(dd,2h,j1＝8.0hz,j2＝12.0hz,-ch2oh),3.25-3.20(dd,2h,j1＝7.2hz,j2＝12.0hz,-ch2nh-),3.11-3.06(dd,2h,j1＝8.0hz,j2＝12.0hz,-ch2nh-),2.06(t,2h,j＝8.0hz,-ch2co-),1.54-1.47(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.30-1.24(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.65,165.46,136.27,133.88,129.53,128.77,60.44,41.85,39.63,35.76,29.32,26.65,25.69.esi-ms:calcdforc15h21n2o3[m+h]+313.1241,found313.1317.。
n-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-6-oxohexyl)-4-(trifluoromethyl)benzamide(e4):白色固体粉末；yield:45％；mp：105.0-106.3℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.65(t,1h,j＝5.6hz,-arconh-),7.99(d,2h,j＝8.0hz,ar-h2,ar-h6),7.81(d,2h,j＝8.0hz,ar-h3,ar-h5),7.73(t,1h,j＝5.8hz,-conh-),4.61(s,1h,-oh),3.34-3.29(dd,2h,j1＝6.4hz,j2＝12.8hz,-ch2oh),3.24-3.19(dd,2h,j1＝7.2hz,j2＝12.8hz,-ch2nh-),3.07-3.02(dd,2h,j1＝6.0hz,j2＝11.6hz,-ch2nh-),2.03(t,2h,j＝7.2hz,-ch2co-),1.52-1.43(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.27-1.19(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.63,165.37,138.92,131.57,128.51,125.76,125.73,60.44,41.85,39.8,35.75,29.25,26.63.25.48.esi-ms:calcdforc16h21f3n2o3[m+h]+347.1504,found347.1583.。
4-bromo-n-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-6-oxohexyl)benzamide(e5):白色粉末；yield:35％；mp：115.7-118.7℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.49(t,1h,j＝5.6hz,-arconh-),7.74(t,1h,j＝5.4hz,-conh-),7.73-7.72(m,2h,ar-h2,ar-h6),7.64-7.62(m,2h,ar-h3,ar-h5),4.62-4.59(m,1h,-oh),3.35-3.21(dd,2h,j1＝5.6hz,j2＝12.8hz,-ch2oh),3.19-3.14(dd,2h,j1＝6.4hz,j2＝12.4hz,-ch2nh-),3.01-2.97(dd,2h,j1＝5.6hz,j2＝11.2hz,-ch2nh-),2.02(t,2h,j＝7.2hz,-ch2co-),1.49-1.42(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.24-1.19(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.62,165.41,133.25,131.27,129.67,126.85,60.43,40.61,39.72,36.45,29.61,25.66,25.21.esi-ms:calcdforc15h21brn2o3[m+h]+357.0736,found357.0806and359.0825.。
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n-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-6-oxohexyl)-4-methylbenzamide(e11):白色粉末；yield:45％；mp：116.5-118.5℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.31(t,1h,j＝5.6hz,-arconh-),7.72(t,1h,j＝5.2hz,-conh-),7.69(d,2h,j＝8.0hz,ar-h2,ar-h6),7.21(d,2h,j＝8.0hz,ar-h3,ar-h5),4.59(s,1h,-oh),3.34-3.21(dd,2h,j1＝6.0hz,j2＝12.4hz,-ch2oh),3.20-3.15(dd,2h,j1＝7.2hz,j2＝13.0hz,-ch2nh-),3.07-3.03(dd,2h,j1＝6.0hz,j2＝11.8hz,-ch2nh-),2.30(s,3h,-ch3),2.02(t,2h,j＝7.0hz,-ch2co-),1.50-1.43(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.26-1.19(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.52,165.65,134.31,131.75,129.79,125.22,61.29,51.79,35.27,29.36,26.70,25.55,21.43.esi-ms:calcdforc16h24n2o3[m+h]+293.1787,found293.1868.。
4-fluoro-n-(6-((2-hydroxyethyl)amino)-6-oxohexyl)benzamide(e12):淡黄色粉末；yield:51％；mp:131.2-132.9℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.43(t,1h,j＝5.6hz,-arconh-),7.88-7.83(m,2h,ar-h2,ar-h6),7.73(t,1h,j＝6.0hz,-conh-),7.28-7.22(m,2h,ar-h3,ar-h5),4.60(t,1h,j＝5.6hz,-oh),3.35-3.30(dd,2h,j1＝6.0hz,j2＝12.0hz,-ch2oh),3.20-3.16(dd,2h,j1＝6.8hz,j2＝12.8hz,-ch2nh-),3.07-3.02(dd,2h,j1＝6.0hz,j2＝12.0hz,-ch2nh-),2.02(t,2h,j＝7.6hz,-ch2co-),1.50-1.43(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.26-1.19(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.64,165.46,162.97,130.23,130.14,115.68,60.44,41.85,35.77,29.37,26.65,25.50.esi-ms:calcdforc15h21fn2o3[m+h]+297.1536,found297.1622.。
4-fluoro-n-(6-((2-hydroxypropyl)amino)-6-oxohexyl)benzamide(e13):淡黄色粉末；yield:41％；mp:99.3-100.8℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.33(t,1h,j＝5.2hz,-arconh-),7.88-7.84(m,2h,ar-h2,ar-h6),7.58(t,1h,j＝5.2hz,-conh-),7.25-7.20(m,2h,ar-h3,ar-h5),4.53-4.49(m,1h,-oh),3.56(s,3h,-ch3),3.29-3.25(dd,2h,j1＝6.8hz,j2＝12.4hz,-ch2oh),3.20-3.16(dd,2h,j1＝6.4hz,j2＝12.0hz,-ch2nh-),2.96-2.91(dd,2h,j1＝6.0hz,j2＝12.4hz,-ch2nh-),2.05(t,2h,j＝6.4hz,-ch2co-),1.52-1.45(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.27-1.20(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.65,167.34,166.12,129.37,129.82,115.66,68.27,49.30,39.54,36.35,29.81,25.57,25.31,21.01.esi-ms:calcdforc16h23fn2o3[m+h]+311.1693,found311.1736.。
n-(6-((2-hydroxypropyl)amino)-6-oxohexyl)-3-(trifluoromethyl)benzamide(e14):白色粉末；yield:43％；mp：106.3-108.1℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.64(t,1h,j＝5.6hz,-arconh-),7.98(d,2h,j＝8.4hz,ar-h4,ar-h6),7.81(d,2h,j＝8.4hz,ar-h2,ar-h3),7.69(t,1h,j＝6.0hz,-conh-),4.63-4.59(t,1h,-oh),3.55(s,3h,-ch3),3.22-3.14(m,4h,-ch2oh,-ch2nh-),2.94-2.89(dd,2h,j1＝6.0hz,j2＝12.0hz,-ch2nh-),2.04(t,2h,j＝7.4hz,-ch2co-),1.48-1.44(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.23-1.16(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.63,167.42,134.53,131.81,130.82,129.32,128.45,123.28,123.37,68.21,49.28,39.50,36.42,29.45,25.36,25.13,21.13.esi-ms:calcdforc17h23f3n2o3[m+h]+361.1661,found361.1696.。
4-bromo-n-(6-((2-hydroxypropyl)amino)-6-oxohexyl)benzamide(e15):淡黄色粉末；yield:39％；mp:123.5-125.6℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6,tms,ppm):δ8.48(t,1h,j＝5.4hz,-arconh-),7.73(d,2h,j＝8.8hz,ar-h2,ar-h6),7.68(t,1h,j＝6.4hz,-conh-),7.64-7.62(d,2h,j＝8.8hz,ar-h3,ar-h5),4.62(s,1h,-oh),3.55(s,3h,-ch3),3.19-3.14(dd,2h,j1＝6.4hz,j2＝12.4hz,-ch2oh),2.94-2.89(dd,2h,j1＝5.2hz,j2＝12.0hz,-ch2nh-),2.84-2.79(dd,2h,j1＝6.4hz,j2＝12.4hz,-ch2nh-),2.04(t,2h,j＝7.6hz,-ch2co-),1.48-1.44(m,4h,-ch2-,-ch2-),1.25-1.16(m,2h,-ch2-).13c-nmr(100mhz,dmso-d6,tms,ppm):172.56,167.35,133.41,131.56,129.76,126.53,68.12,49.42,39.448,36.51,29.81,25.38,25.72,21.01.esi-ms:calcdforc16h23brn2o3[m+h]+371.0892,found371.0926.。
二、体外细胞试验
1)实验材料
细胞株：3种肿瘤细胞株均由兰州大学基础医学院实验中心提供，包括：hela(人宫颈癌细胞株)，a549(人非小细胞肺癌细胞株)和hep-g2(人肝癌细胞株)，wi-38细胞(正常人胚肺成纤维细胞，atcc细胞库)，所有细胞株均冻存于液氮中。
仪器：超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，二氧化碳培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)，无菌过滤器(0.22μm，兰州科恒化玻公司)，96孔板(美国corning公司)，分析天平(兰州金昱电子衡器)，高压灭菌锅(厦门致微仪器有限公司)，超净工作台(vs-840u，沪净净化)，sigma冷冻离心机(北京五洲东方科技发展有限公司)，i-mark酶标仪(上海拜力科技有限公司)，多种规格移液枪(甘肃瑞德生物有限公司)。
试剂：1640培养基(天津灏洋生物制品)，胎牛血清(gibco公司)，dmem高糖培养基，pbs缓冲盐，胰蛋白酶(sigma公司产品)，青霉素与链霉素双抗(甘肃red生物有限公司)，mtt(噻唑蓝，amresco公司)，二甲基亚砜(sigma公司产品)，saha(纯度99％，百灵威化学试剂公司)。
2)实验方法及操作步骤
(1)取处于对数期生长的hela、a549和hep-g2肿瘤细胞接种在96孔板中，用细胞计数板计数，调整细胞悬浮液浓度，按照5×103个/ml的浓度每孔加入100μl细胞悬浮液；
(2)空白组只加入100μl不含细胞的培养液，培养箱中37℃培养1-2h至细胞贴壁；
(3)实验组加入按浓度梯度稀释(500、100、20、4、0.8μmol/l)的待测化合物，每个浓度设置三个平行孔，空白对照组不加入化合物，阳性对照组加入相同浓度梯度的saha，置于培养箱中37℃培养；
(4)培养48h后每孔加入10μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，放置在培养箱37℃中继续培养4h，小心弃去上清液，每孔中加入dmso150μl，并充分震荡使甲瓒溶解；
(5)将上述溶液在酶标仪570nm下测定吸光度(od值)，收集数据后计算出抑制率，最后用spss软件计算出ic50的值。
3)实验结果
表1目标化合物对不同细胞株的抑制作用
从表1可以看出，新合成的15种化合物对正常细胞的毒性均小于阳性对照物saha，显示出了本发明的化合物对肿瘤细胞一定的选择性；相比于hep-g2与hela，化合物对a549(ic50＝1.68～33.42μm)细胞株有着较强的敏感性，尤其当化合物苯环4位被苯基取代时的e8活性最佳(ic50＝1.68μm)，显示出优于阳性对照物saha(ic50＝4.85μm)的抑制活性，同时化合物e2(4-二甲氨基)、e9(萘酸)、e10(3,5-二甲基)、e11(4-甲基)对3种细胞株展示出均衡且较好的活性，当化合物zbg端羟基的邻位添加甲基集团时(e13、e14、e15)，其化合物的活性并未有多大改变(对比化合物e12与e13、e5与e15)，当帽端基团的体积较大时(e2、e8、e9、e10)，化合物活性总体偏好，由于此类化合物大部分为4位取代，因此不能判别苯环的几位取代活性较好。
由以上内容可知本发明合成的15种苯甲酰胺衍生物均为首次被设计与合成，它们的结构均经过氢谱、碳谱和质谱的确证；本发明的化合物对体外肿瘤增殖抑制实验结果显示：此类化合物对正常细胞的毒性均较saha小，显示对肿瘤细胞一定的选择性，特别是对人非小细胞肺癌细胞株a549有着较强的敏感性，为hdacis的临床前研究提供了一定基础。