硅藻土基荷正电绿色絮凝剂对富硒小球藻产品的采收方法与流程

本发明属于一种可应用于食品保健、医疗领域的富含有机硒产品的制备方法，也可据此开发绿色絮凝剂用于富营养水体爆发时蓝绿藻的絮凝去除，具体地说，是涉及一种富硒小球藻的培养方法和一种绿色无污染微藻絮凝剂的制备方法。

背景技术：

硒是一种天然的微量元素，并且是人体和其他哺乳动物必须的元素之一，硒具有保护生物膜、清除自由基、抗癌、抗衰老、增进免疫力等生理功能。然而无机硒具有毒性，其使用剂量和范围都受到严格的控制，过量的摄入无机硒可能导致中毒，而缺乏硒又会导致克山病、大骨节病等多种疾病。与无机硒化合物相比，有机硒化合物的毒性很低，且生物利用率更高。目前，有机硒并不能通过人工合成，因此利用生物合成有机硒具有重要的意义。

小球藻(chlorella)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，它是一种高效的光合植物，易于培养、繁殖速度快，分布极广。我国常见的种类有蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)、椭圆小球藻(chlorellaellipoidea)和普通小球藻(chlorellavulgaris)。小球藻含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸(pufa)、生物多糖、维生素、微量元素和活性代谢物等。其中蛋白核小球藻细胞内的蛋白质含量高，营养价值最高。研究表明，小球藻多糖和糖蛋白具有抗肿瘤活性、抑制癌细胞、增强免疫和抗感染能力、解毒保肝、降低血压等作用。因此，小球藻具有增强营养和保健的双重作用，已被fao列为21世纪人类的绿色营养源健康食品。

生物转化硒主要是生物体利用施加的外源硒，通过同化功能使硒进入蛋白质、多糖或脂类等生物大分子中，从而得到富含硒的有机产品。通过食物链增加人和动物对硒的摄入。因此利用小球藻作为生物载体，通过微藻的生物转化功能，将无机硒转化为有机硒，获得富硒小球藻，以此为基础，可得到兼具硒和小球藻多种营养和保健功能的富硒小球藻产品。

然而，微藻是一类个体微小(3～30μm)的藻类，且在培养液中的浓度很低(＜1g/l)。这决定了对于工业规模的微藻养殖而言，其采收难度大、成本高。目前，絮凝沉降是微藻采收和去除应用最为广泛的技术之一。常用的化学絮凝剂主要是无机高分子聚合物(聚合氯化铁、聚合氯化铝等)，但是金属阳离子的加入会对人体健康造成不利影响。因此，寻求一种高效率、绿色无污染的絮凝剂是当前亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何获得具有一定营养和保健功能的富硒微藻产品。本发明围绕富硒小球藻的培养和绿色絮凝剂的制备这两个过程，研发一种壳聚糖改性硅藻土的绿色絮凝剂，采收富硒小球藻产品。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下的技术方案予以实现：

一种硅藻土基荷正电绿色絮凝剂对富硒小球藻产品的采收方法，其特征在于，包括：采用含有亚硒酸盐的培养液培养蛋白核小球藻，得到富硒培养后的小球藻液；在富硒培养后的小球藻液中加入硅藻土基荷正电绿色絮凝剂，静置后，弃去上清液，采收富硒小球藻。

优选地，所述的培养液中亚硒酸盐的含量为0-20mg/l，不包括0，更优选地，所述的培养液中亚硒酸盐的含量为5mg/l。

优选地，所述的添加亚硒酸钠的方式为一次性添加。

优选地，所述的培养时间为5d，培养结束后进行采收时小球藻的最高密度可达16×10⁶个/ml。

优选地，所述的采用含有亚硒酸盐的培养液培养蛋白核小球藻的具体步骤包括：将蛋白核小球藻接种到bg11培养液中，接种量为5％-15％，初始密度为6×10⁶个/ml，在所述的培养液中添加亚硒酸钠，在温度20-25℃，ph＝7.1-7.3，光照强度2000-3000lux，每天24h光照的条件下进行培养，培养时间为5-7d。

优选地，所述的bg11培养液成分包括nano31.5g/l，kh2po40.04g/l，mgso4·7h2o0.075g/l，cacl2·h2o0.036g/l，柠檬酸0.006g/l，柠檬酸铁铵0.006g/l，edtana20.001g/l，naco30.02g/l，a51ml/l。

优选地，所述的硅藻土基荷正电绿色絮凝剂的制备方法包括：将壳聚糖溶于盐酸溶液中搅拌至完全溶解，得到壳聚糖-盐酸溶液，在壳聚糖-盐酸溶液中加入硅藻土，常温下搅拌后过滤，然后干燥，制得硅藻土基荷正电绿色絮凝剂。

更优选地，所述的搅拌时间为12-36h，干燥温度为70-80℃。

更优选地，所述的硅藻土与壳聚糖的质量比为1∶4-8，所述的盐酸溶液的浓度为4-6mol/l，壳聚糖与盐酸溶液的比例为2-4g/100ml。此时，壳聚糖改变粘土颗粒表面特性和表面电性，使其带正电荷，而小球藻表面常带负电荷，使得微藻的絮凝效率大幅度提高。同时在该质量比下粘土矿物也有效的增加了絮体的重量，使得聚集起来的絮体更加紧密、沉降速度更快，更有利收集。

更优选地，所述的硅藻土与壳聚糖的质量比为1∶6或1∶10，所述的盐酸溶液的浓度为5mol/l，壳聚糖与盐酸溶液的比例为3g/100ml。

优选地，所述的硅藻土基荷正电绿色絮凝剂在小球藻液中的浓度为0.1-0.2g/l，调节藻液ph在8-9范围内，搅拌20-40s后，静置时间为1-2h。

优选地，所述的富硒小球藻的采收率高达90％-97％，在-50℃冷冻干燥12-24h，获得富硒小球藻产品。

优选地，所述的硅藻土基荷正电绿色絮凝剂对富硒小球藻产品的采收方法还包括：采用icp-ms检测富硒小球藻中的总硒含量及无机硒含量。

更优选地，所述的总硒含量的测定方法包括：取干燥后的富硒小球藻粉0.1g，加入15ml体积比为4∶1的65％hno3和70％hcio4的混合酸，盖上表面皿消化过夜，次日置于120-180℃的电热板上加热，2-3h后补加65％硝酸2-3ml，当溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余体积为2ml，冷却，用1％的hno3定容至25ml容量瓶中，用icp-ms测总硒含量。

更优选地，所述的无机硒含量的测定方法包括：取干燥后的富硒小球藻粉0.1g，加入30ml蒸馏水，沸水浴30min，然后超声粉粹(功率300w，超声时间5s，间隔时间5s)15min，20℃下4000r/min离心10min，取上清提取液10ml，加入20ml环己烷萃取20min，再分取5ml水相，加入10ml15％的盐酸溶液酸化30min，冷却后，转入50ml容量瓶定容，用icp-ms测无机硒含量，然后用总硒减去无机硒即为有机硒的含量。

优选地，所述的富硒小球藻的硒含量为140～150mg/kg。

壳聚糖是目前被普遍认为安全有效的微藻絮凝剂，它是一种天然高分子化合物，无毒且可生物降解，它和微藻的化学成分类似，对后续加工没有不良影响。但是，壳聚糖表面荷正电，化学性质不活泼，溶解性差，单独使用用量大、成本高，且对ph的适用范围限制较大。硅藻土作为一种成本低廉、天然无污染的材料，具有一定的絮凝能力，但是粘土矿物自身的溶胶性质差、迅速絮凝和沉淀能力较低。因此采用壳聚糖改性硅藻土絮凝微藻，一方面通过壳聚糖改变硅藻土表面荷电特性，使其易和带负电的微藻结合强化其絮凝能力，另一方面也能较好的发挥壳聚糖的网捕架桥作用。两者协同作用，不仅提高了絮凝能力，扩大了对ph的适用范围，减少了壳聚糖的用量，降低成本，而且没有二次污染，不需要再次分离，可与微藻一起应用于生物医疗、食品加工等各个领域。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种利用改性壳聚糖-硅藻土为絮凝剂采收富硒小球藻产品的方法。该方法通过采收培养富硒小球藻可得到有机硒含量高达73％的产品，其中培养步骤简单，成本低廉，操作方便。并且采用了无毒无害的藻絮凝剂，制备方法简单，绿色无污染，对小球藻的采收率可达90-97％。本方法可应用于大规模的生产，而且所得的产品可应用于食品保健、医疗领域，创造了一定的经济价值。

本发明培养方法简单，小球藻生长速率快，富硒能力强，小球藻可将高毒性的无机硒转化为无毒易利用的有机硒。壳聚糖改变了硅藻土颗粒表面特性和表面电性，使微藻的絮凝效率大幅度提高并且絮体更加紧密。同时该复合絮凝剂制备工艺简单、高效快速、绿色无污染、使用方便安全。该方法可应用大规模的培养收集富硒小球藻产品。

附图说明

图1为蛋白核小球藻细胞密度与光密度的标准曲线；

图2为不同浓度亚硒酸钠对蛋白核小球藻生长的影响；

图3为蛋白核小球藻的富硒量随培养时间的变化曲线；

图4为改性不同粘土矿物对小球藻采收率的影响；

图5为壳聚糖-硅藻土絮凝剂在不同配比对小球藻采收率的影响；

图6为壳聚糖-硅藻土絮凝剂在不同ph对小球藻采收率的影响；

图7为壳聚糖-硅藻土絮凝剂不同投加量对小球藻采收率的影响采收率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

采用含有亚硒酸盐的培养液培养蛋白核小球藻：

选用蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)(藻种购于中国科学院野生生物种质-淡水藻种获库)。将蛋白核小球藻接种到bg11培养液(包括nano31.5g/l，kh2po40.04g/l，mgso4·7h2o0.075g/l，cacl2·h2o0.036g/l，柠檬酸0.006g/l，柠檬酸铁铵0.006g/l，edtana20.001g/l，naco30.02g/l，a51ml/l)中，接种量为10％，初始密度为6×10⁶个/ml，在所述的培养液中一次性添加亚硒酸钠，其浓度分别为0mg/l、5mg/l、8mg/l、10mg/l、20mg/l。在温度20-25℃，ph＝7.2，光照强度2000-3000lux，每天24h光照的条件下进行培养，培养时间为7天，每天定时取藻液在其680nm处测定吸光度，观察不同浓度亚硒酸钠对小球藻的生长影响，确定最佳的培养浓度。由图1可知一次性添加亚硒酸钠浓度为5mg/l对小球藻的生长有较好的促进作用。

实施例2

一种硅藻土基荷正电绿色絮凝剂对富硒小球藻产品的采收方法，具体步骤为：

(1)制备硅藻土基荷正电绿色絮凝剂：

将壳聚糖1.5g溶于5mol/l50ml的盐酸溶液中搅拌至完全溶解，得到壳聚糖-盐酸溶液，在壳聚糖-盐酸溶液中加入硅藻土，所添加的硅藻土与壳聚糖的质量比为1∶6，常温下搅拌24h后过滤，然后于75℃下干燥，研磨，过200目筛，制得硅藻土基荷正电绿色絮凝剂。

(2)采用含有亚硒酸盐的培养液培养蛋白核小球藻：采用选用蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)(藻种购于中国科学院野生生物种质-淡水藻种获库)。将蛋白核小球藻接种到bg11培养液(包括nano31.5g/l，kh2po40.04g/l，mgso4·7h2o0.075g/l，cacl2·h2o0.036g/l，柠檬酸0.006g/l，柠檬酸铁铵0.006g/l，edtana20.001g/l，naco30.02g/l，a51ml/l)中，接种量为10％，初始密度为6×10⁶个/ml，在所述的培养液中一次性添加亚硒酸钠，其浓度为5mg/l。在温度20-25℃，ph＝7.2，光照强度2000-3000lux，每天24h光照的条件下进行培养，培养时间为7天，每天收集富硒培养后的小球藻液，在富硒培养后的小球藻液中加入硅藻土基荷正电绿色絮凝剂，所述的硅藻土基荷正电绿色絮凝剂在小球藻液中的浓度为0.15g/l，调节藻液ph在8-9范围内，快速搅拌30s后，静置120min后，弃去上清液，采收富硒小球藻沉淀，用蒸馏水冲洗数遍，在-50℃冷冻干燥12-24h，得到藻粉。

采用icp-ms检测小球藻细胞中的总硒含量：取干燥后的藻粉0.1g，加入15ml体积比为4∶1的65％hno3和70％hcio4的混合酸，盖上表面皿消化过夜，次日置于120-180℃的电热板上加热，2-3h后补加65％硝酸2-3ml，当溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余体积为2ml，冷却，用1％的hno3定容至25ml容量瓶中，用icp-ms测总硒含量。

采用icp-ms检测小球藻细胞中的无机硒含量：取干燥后的藻粉0.1g，加入30ml蒸馏水，沸水浴30min，然后超声粉碎(功率300w，超声时间5s，间隔时间5s)15min，20℃下4000r/min离心10min，取上清提取液10ml，加入20ml环己烷萃取20min，再分取5ml水相，加入10ml15％的盐酸溶液酸化30min，冷却后，转入50ml容量瓶定容，用icp-ms测无机硒含量，然后用总硒减去无机硒即为有机硒的含量。

通过小球藻细胞中的总硒含量及无机硒含量，确定最佳的培养时间。由图2可知，小球藻细胞内的硒含量将随着培养时间的延长呈现现增加后平稳的趋势，培养5d时，在亚硒酸钠浓度为5mg/l时，小球藻细胞内的总硒含量可达到140-150mg/kg，其中有机硒就占73％。

实施例3

一种硅藻土基荷正电绿色絮凝剂对富硒小球藻产品的采收方法，具体步骤为：

采用选用蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)(藻种购于中国科学院野生生物种质-淡水藻种获库)。将蛋白核小球藻接种到bg11培养液(包括nano31.5g/l，kh2po40.04g/l，mgso4·7h2o0.075g/l，cacl2·h2o0.036g/l，柠檬酸0.006g/l，柠檬酸铁铵0.006g/l，edtana20.001g/l，naco30.02g/l，a51ml/l)中，接种量为10％，初始密度为6×10⁶个/ml，在所述的培养液中一次性添加亚硒酸钠，其浓度为5mg/l。在温度20-25℃，ph＝7.2，光照强度2000-3000lux，每天24h光照的条件下进行培养，培养时间为5天，收集富硒培养后的小球藻液。

将壳聚糖溶于5mol/l的盐酸溶液中搅拌至完全溶解，得到壳聚糖盐酸溶液，在壳聚糖盐酸溶液中加入膨润土、硅藻土、沸石，在常温下搅拌24h充分搅匀后过滤，于75℃下干燥，研磨，过200目的筛子，分别制成配比为1∶2、1∶6、1∶10、1∶14的壳聚糖-膨润土絮凝剂、壳聚糖-硅藻土絮凝剂和壳聚糖-沸石絮凝剂。

在富硒培养后的小球藻液中加入上述絮凝剂，絮凝剂的浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6g/l，调节ph分别至2-10，快速搅拌30s，静置沉降，观察絮凝效果。后取液面下3cm处藻液测其吸光度od680值(a)，计算采收率。通过比较三种絮凝剂的采收率确定最佳絮凝剂。

采收率(％)＝(1-a/a0)×100％；(a0为空白)

由图3至图7可知，絮凝剂的浓度为0.2g/l，静置1h后，小球藻的采收率可达80％以上，而静置2h后，小球藻的絮凝率可达到90％左右，其中壳聚糖-硅藻土絮凝剂絮凝效果最好，且当其配比为1∶6和1∶10，ph8-9时的絮凝效果最好，zeta电位也由原来的-50.6mv变为-3.2mv，小球藻的采收率可到达97％以上，当絮凝剂浓度大于0.2g/l时，采收率仅提高了1％-2％，因此为了节约成本，选取1：6壳聚糖-硅藻土絮凝剂，选择投加浓度为0.2g/l。