本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及到一种实验大小鼠的dna免疫及佐剂使用的方法。
背景技术：
：基因免疫是90年代初期建立和发展起来的一门新的免疫学理论和技术。质粒dna可在受者体内细胞中以环状、非整合、非复制状态存在达1个月之久。质粒dna可直接被受者动物体内细胞摄取并表达基因产物蛋白质，从而奠定了dna免疫的基础。通过dna免疫技术，目的基因dna可直接在受者动物体内产生抗原，刺激受者动物机体产生对目的基因蛋白质的免疫反应并产生抗体。产生了免疫反应的动物进而可以用作动物血清抗体生产，还可以用于单克隆抗体药物的研发。使用dna免疫技术无需在体外生产及纯化蛋白抗原，使很多以前难以用传统的蛋白质体外表达方法而获得纯化蛋白质抗原的项目得以进行与实施。因此减少了蛋白表达纯化的工作、节约了人力和试剂物料的成本。dna免疫产生的抗体识别天然的蛋白结构，体内表达的抗原产生的抗体亲和力非常高。与传统的蛋白免疫相比，免去了繁琐的蛋白纯化过程。而且表达的蛋白能最大程度保持蛋白质的天然结构，这对于生产识别目标抗原天然结构的高亲和力治疗性抗体是非常重要的。现有技术中，如nationalinstitutesofhealth(nih)的文献中，就公开了几种dna免疫方法。但是在这些常规的dna免疫方法下，并未能够产生理想的高抗体血清滴度，受者动物血清效价低(＜1:1000)，因而不能满足新药研发需要。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于，提供一种提高dna免疫的动物血清中抗体滴度方法，其能够增加受者动物免疫反应，产生高抗体滴度，为单克隆抗体新药研发提供更多机会。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种使用大剂量dna免疫技术免疫动物使血清中抗体滴度提高的方法，包括：1)将蛋白质抗原表达质粒、cpg-odn佐剂和aluminumphosphate佐剂混合，制成混合液；2)用该混合液对免疫动物进行多个部位的注射免疫，每间隔7-14天重复注射免疫一次，经过6-15次注射免疫后检测免疫动物的血清中针对特异性抗原的抗体滴度。抗体滴度高，则说明免疫动物血清中抗体含量高。所述免疫动物均为spf级实验动物，大鼠为spraguedawley(sdrat)、小鼠为balb/cmouse。所述蛋白质抗原表达质粒的用量为每只sd大鼠或balb/c小鼠100～500ug，所述cpg-odn佐剂的用量为每只大鼠或小鼠5-15ug，所述aluminumphosphate佐剂用量体积为免疫材料总体积的1/2。所述蛋白质抗原表达质粒的用量为每只大鼠或小鼠100～500ug，所述cpg-odn佐剂的用量为每只sd大鼠或balb/c小鼠10ug，所述aluminumphosphate佐剂用量体积为免疫材料总体积的1/2。所述进行多个部位的注射免疫，是指动物试验中常规的注射给药部位。所述多个部位包括股二头肌部位、背部皮肤内、背部皮下部位。优选的，每7-14天重复注射一次。所述经过2次免疫后检测动物的血清中针对特异性抗原的抗体滴度。所述对每只sd大鼠或balb/c小鼠的股二头肌部位、背部皮肤内(小鼠除外)、背部皮下部位进行注射，每7-14天重复注射一次，每免疫两次后3-7天采血，检测免疫动物的血清中针对特异性抗原的抗体滴度。本发明还提供一种使用大剂量dna和蛋白质抗原交替使用技术使动物血清中的抗体滴度提高的方法，包括：1)将蛋白质抗原表达质粒、cpg-odn佐剂和aluminumphosphate佐剂混合，制成混合液1；将蛋白质抗原、cpg-odn佐剂和aluminumphosphate佐剂混合，制成混合液2；其中蛋白质为10-60ug/rat，cpg-odn佐剂10ug/rat，aluminumphosphate佐剂用量体积为免疫材料总体积的1/2。2)用质粒dna-佐剂混合液1对动物进行股二头肌和背部皮肤内注射，间隔7-14天，使用蛋白质-佐剂混合液2对动物进行足底和背部皮下注射，质粒dna-佐剂混合液1与蛋白质抗原-佐剂混合液2交替使用为一个免疫流程。每执行2个交替免疫流程后，对动物进行尾静脉采血，并检测血清中针对该蛋白质抗原的特异性抗体滴度。抗体滴度高，则说明免疫动物血清中抗体含量高。采用dna-佐剂与蛋白质-佐剂交替免疫方法，除了能提高血清中抗体滴度之外，还能增加单克隆抗体的多样性。所述免疫动物均为spf级实验动物，大鼠为spraguedawley(sdrat)、小鼠为balb/cmouse。所述混合液1中蛋白质抗原表达质粒的用量为每只大鼠或小鼠100～500ug，所述cpg-odn佐剂的用量为每只大鼠或小鼠5-15ug，所述aluminumphosphate佐剂用量体积为免疫材料总体积的1/2。所述免疫部位包括股二头肌部位、背部皮肤内、背部皮下部位。所述每间隔7-14天重复注射一次。所述经过2次注射免疫后检测免疫动物的血清中针对特异性抗原的抗体效价。所述对每只sd大鼠或balb/c小鼠的股二头肌部位、背部皮肤内(小鼠除外)、背部皮下部位进行免疫注射，每7-14天重复注射一次，每免疫两次后的3-7天采血，检测免疫动物的血清中针对特异性抗原的抗体滴度。本发明所提供的一种使用大剂量dna免疫技术免疫动物使血清中抗体滴度提高的方法，其有益效果在于：1)本发明的方法能够明显增加受者动物免疫反应，提高血清中抗体滴度，获得比常规dna免疫更高的血清滴度。通过细胞融合后获得更多的针对靶点的阳性单克隆抗体，为单克隆抗体新药研发奠定基础。2)本发明提供的dna免疫与蛋白质免疫交替使用的免疫方法，在提高血清中抗体滴度的基础上，还能增加单克隆抗体的多样性，为后续单克隆抗体药物的选择增大了选择的机会。3)本发明的方法能极大的节省项目成本，增加效益。生产dna的价格大约只有生产蛋白质的1/4–1/3(购买每毫克蛋白质抗原约1.5-2万人民币，每克dna约5000人民币)。4)本发明的方法能极大的缩短材料制备时间，从而节约成本。生产蛋白质的周期大约8-12周，而本发明中生产dna的周期为4-5周。5)使用dna免疫技术无需在体外生产及纯化蛋白抗原，使很多以前难以用传统的蛋白质体外表达方法获得纯化蛋白质抗原的项目得以进行与实施。6)本发明的方法较蛋白质免疫生产出的单克隆抗体在高亲和力方面更具有优势，尤其是在膜蛋白和其它难以产生抗体的抗原最理想的方式。附图说明图1为groupa三只大鼠第三次采血血清效价检测图2为groupd三只大鼠第三次采血血清效价检测图3为groupe三只大鼠第三次采血血清效价检测具体实施方式下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未做特殊说明的，以下具体实施方式中所使用的试剂及材料均为本领域的常规商品化试剂，或利用本领域的常规商品化试剂按照本领域常规实验技术手段制得。实施例1动物血清效价具体实验方案如下：将15只sdrats随机分为5组，每三只鼠为设为一组，分别为a组、b组、c组、d组、e组。每组进行动物编号分别为rat1#，rat2#，rat3#。经过一周观察及检疫期过后，动物适应新环境且健康状态下才可实施免疫。免疫前各组动物以尾静脉的方式采取空白全血(pre-bleed)，并8000rpm，5min离心收集血清。a组免疫方案：1)蛋白质、cpg-odn佐剂和aluminumphosphate佐剂混合液制备：其中蛋白质为40-60ug/rat，cpg-odn佐剂10ug/rat，aluminumphosphate佐剂用量体积为免疫材料总体积的1/2。2)用该蛋白质-佐剂混合液对动物进行足底和背部皮下注射免疫，间隔14天，使用同样的蛋白质-佐剂混合液再次进行免疫。每一次免疫注射及间隔14天为一个免疫流程。每执行2个免疫流程后，对动物进行尾静脉采血，并检测血清中针对该蛋白质抗原的特异性抗体滴度。b组免疫方案：1)dna和pbs制成混合液；其中dna用量为100-500ug/rat。2)用该dna混合液对在动物股二头肌肌肉内注射免疫，间隔7天，使用同样的dna抗原混合液再次进行免疫。每一次注射免疫及随后间隔7天，为一个免疫流程。每执行4个免疫流程后，对动物进行尾静脉采血，并检测血清中针对该蛋白质抗原的特异性抗体滴度。c组免疫方案：1)dna和pbs制成混合液；其中dna用量为100-500ug/rat。2)用该dna混合液对动物进行背部皮肤内注射免疫，间隔7天，使用同样的dna抗原混合液再次进行免疫。每一次注射免疫及随后间隔7天，为一个免疫流程。每执行4个免疫流程后，对动物进行尾静脉采血，并检测血清中针对该蛋白质抗原的特异性抗体滴度。d组免疫方案1)dna、cpg-odn佐剂和aluminumphosphate佐剂混合，制成混合液；其中dna为100-500ug/rat，cpg-odn佐剂10ug/rat，aluminumphosphate佐剂用量体积为免疫材料总体积的1/2。2)用该dna-佐剂混合液在动物股二头肌进行肌肉内注射，间隔7天，使用同样的dna抗原混合液再次进行免疫。每一次注射免疫及随后间隔7天，为一个免疫流程。每执行4个免疫流程后，对动物进行尾静脉采血，并检测血清中针对该蛋白质抗原的特异性抗体滴度。e组免疫方案1)dna、cpg-odn佐剂和aluminumphosphate佐剂混合，制成混合液；其中dna为100-500ug/rat，cpg-odn佐剂10ug/rat，aluminumphosphate佐剂用量体积为免疫材料总体积的1/2。蛋白质、cpg-odn佐剂和aluminumphosphate佐剂混合，制成混合液；其中蛋白质为10-60ug/rat，cpg-odn佐剂10ug/rat，aluminumphosphate佐剂用量体积为免疫材料总体积的1/2。2)用dna-佐剂混合液对动物进行股二头肌和背部皮肤内注射，间隔7天，使用蛋白质-佐剂混合液对动物进行足底和背部皮下注射，dna-佐剂与蛋白质-佐剂交替使用为一个免疫流程。每执行2个交替免疫流程后，对动物进行尾静脉采血，并检测血清中针对该蛋白质抗原的特异性抗体滴度。经检测，a、b、c、d、e五组试验中，各组受试动物血清滴度数据如下表所示。说明：/为不再进行免疫及采血组。以上实验数据得知，a、b、c、d及e组动物的免疫前空白血清均未检测出特异性抗体。经过第一个取血周期后，5组动物均检测出低滴度血清特异性抗体，但各组动物抗体滴度无明显差异。经过第二个取血周期后，dna免疫的b、c及d组，抗体滴度进一步提高，而dna+蛋白免疫的e组有显著提高；经过第三个取血周期后，添加佐剂的d组动物血清抗体滴度水平相较无佐剂的b组动物有进一步提高；dna+蛋白免疫的e组的抗体滴度水平较d组有更显著的提高；经过第四个取血周期后，dna+蛋白免疫的e组的抗体滴度水平显著高于a组和d组。实施例2不同免疫方式产生的抗体亚型类型对dna免疫、蛋白质免疫所获得的杂交瘤产生的抗体采用间接酶联免疫吸附实验方法进行亚型鉴定，具体实验操作如下：1)包被goatantiratigg1,igg2a,igg2b,0.5-4ug/ml，50ul/well，4℃，包被过夜。2)用1xpbs缓冲液洗板1次，300ul/well。加封闭液(2％bsa-1xpbs)，200ul/well，室温，孵育1小时。3)用1xpbs缓冲液洗板3次，300ul/well。加入一抗(杂交瘤上清)，50ul/well，室温，孵育2小时。4)用1xpbs缓冲液洗板3次，300ul/well。加二抗(mouseantiratiglambdalightchain,1:2000)，室温，孵育1小时。5)用1xpbs缓冲液洗板3次，300ul/well。加goatantirat-igg-fc-biotin,1:5000,室温，1小时。6)用1xpbs缓冲液洗板3次，300ul/well。加sa-hrp1:20000,室温，1小时。7)用1xpbs缓冲液洗板6次，300ul/well。加tmb显色液，室温，12分钟。8)加终止液(2mhcl)，50ul/well。9)读板(od450值)。dna免疫组，蛋白免疫组抗体亚型数据如下表所示。免疫方式igg2aigg2bdna免疫(67个)2641蛋白免疫(64个)591综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。当前第1页12