用于亚细胞尺度细胞共定位的DNA纳米成像探针的制备方法及其产品和应用与流程

本发明提出一种用于亚细胞尺度细胞共定位的dna纳米成像探针的制备方法及其产品和应用。具体涉及将标记有特定荧光分子的dna单链，通过自组装，修饰在dna三角形折纸结构上，成为一种dna成像探针，从而用于实现细胞器共定位的作用。由于dna折纸结构的小尺寸和较好的生物相容性，本发明在亚细胞尺度成像、肿瘤检测及药物机理研究领域有较大的应用前景。

背景技术：

目前所存在的针对亚细胞尺度成像和细胞器共定位的纳米探针主要有以下几类：基于磁性材料的纳米探针，这类纳米探针主要以铁或铁的化合物为基体；基于纳米金及其复合物的检测探针；以及基于其他无机纳米材料，如碳纳米管及其复合物的纳米探针等。这类探针组成通常为无机物或包含金属物质，具有一定的生物毒性，组织相容性较差，代谢困难且机理不明。因此，制备一种新型的安全的纳米探针就成为了当务之急。已有研究将dna材料用于特异性识别dna序列（一种用于特异性识别dna序列的纳米探针及其应用方法，公开号：cn107245524a），或用于单分子基因分型（一种基于dna折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法及其应用）。鲜有将dna折纸纳米结构用于亚细胞共定位成像的研究。

将dna三角纳米成像探针用于亚细胞尺度的细胞器共定位，不仅生物相溶性好，无细胞毒性，而且荧光分子以及一些短肽类小分子能够很容易的修饰在dna折纸结构上，这就为dna靶向纳米成像探针的构建提供了理论基础，可用于细胞器靶向共定位的研究。同时，由于碱基的精确配对，dna材料能够自组装成具有一定结构尺寸的三维构型，通过调控纳米结构的尺寸以及靶向分子的修饰，该纳米成像探针能够更加容易到达目标部位并清晰成像，具有较高的研究意义和应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术在荧光成像领域的不足，本发明的目的在于：提供一种用于亚细胞尺度细胞共定位的dna纳米成像探针的制备方法。

本发明的再一目的在于：提供一种上述制备方法获得的产品。

本发明的又一目的在于：提供一种上述产品的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于亚细胞尺度细胞共定位的dna纳米成像探针的制备方法，包括如下步骤：有208条订书钉链短链，其中一带有荧光的替换链dna短链与其他序列号的207条订书钉链等量地溶解到milliq水中，使每条链的最终浓度为200nm；将m13mp18单链dna（100nm）与混好的208条短链(200nm)以摩尔浓度比1:5-1：10的比例混合在1×tae-mg²⁺溶液中，其中，m13mp18单链dna的最终浓度为5nm，短链最终浓度为50nm；将混好的溶液放入pcr仪中,设定反应程度95℃持续3分钟，然后缓慢降温至4℃，降温速率为0.2℃/10s。

本发明方法通过在dna链上修饰能够被近红外激发的荧光分子，再设计特定的碱基序列，使dna链能够在一定条件下自组装成dna三角形，不仅可用于细胞正常吞噬纳米颗粒的亚细胞尺度成像研究，还能进一步修饰靶向分子，如肿瘤穿透肽，靶向细胞器的靶向分子。以增强其穿透性和靶向性，用于靶向共定位研究。本发明采用dna材料作为分子探针的基体，具有非常好的生物相容性，在药物递送、亚细胞共定位成像领域具有广阔的应用前景。

所述带有荧光的替换连dna1中的荧光染料为cy5，cy3，fitc，fam。

所述带有荧光dna链为208条订书钉链中的任何一条。如带有荧光的替换链dna为dna1时，其与序列号2至208的207条订书钉链等量地溶解到milliq水中。

本发明提供一种用于亚细胞尺度细胞共定位dna纳米成像探针，根据上述任一所述方法制备得到。

本发明还提供了一种dna纳米成像探针用于亚细胞尺度细胞共定位的应用，将dna纳米成像探针加入细胞培养液中与细胞共孵育培养，根据孵育时间不同探针到达不同的细胞器，培养结束后，弃掉含有dna纳米成像探针的培养液，用pbs冲洗掉残余培养液，然后用多聚甲醛溶液固定细胞，再次用pbs溶液冲洗，加入0.1%的tritonx-100，10分钟，以增加细胞膜通透性，再次用pbs溶液冲洗，加入2%bsa溶液封闭非特异性活性位点，然后加入细胞器特异性一抗孵育，弃掉一抗，pbs冲洗，加入带有荧光的二抗，常温避光孵育，再次pbs冲洗，最后加防荧光淬灭封片液，置于激光共聚焦显微镜观测。

所述细胞器特异性一抗为早期核内体一抗，晚期核内体一抗，溶酶体一抗，高尔基体一抗，细胞核一抗。

由于dna折纸结构的小尺寸和较好的生物相容性，本发明在亚细胞尺度成像、肿瘤检测及药物机理研究领域有较大的应用前景。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明采用dna材料，通过设计dna序列可调换连接不同的荧光，并且易于连接其他靶向分子，可以实现多种波长的荧光检测，以及不同靶向细胞和细胞器的成像；

2、本发明可通过改变dna的结构调控探针在体内的降解时间，使用范围更加灵活可控；

3、本发明使用的dna材料，具有非常好的生物相容性，避免了因为纳米探针聚集可能造成的体内功能区的损害。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

附图1为dna纳米结构电泳图，l1为订书钉链dna，l2为dna三角形折纸结构；

附图2为dna纳米成像探针体外细胞共孵育12小时激光共聚焦显微镜成像图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

将带有荧光cy5的替换链dna1与dna2-208的207条订书钉链等量地溶解到milliq水中，使每条链的最终浓度为200nm；将m13mp18单链dna（100nm）与混好的208条短链(200nm)以摩尔浓度比1:5的比例混合在1×tae-mg²⁺溶液中，其中m13mp18单链dna的最终浓度为5nm，短链最终浓度为50nm。将混好的溶液放入pcr仪中,设定反应程度95℃持续3分钟，然后缓慢降温至4℃，降温速率为0.2℃/10s。得到dna纳米成像探针。

将上述步骤中所制备的dna纳米成像探针加入细胞培养液中与细胞共孵育培养12小时。培养结束后，弃掉含有dna纳米成像探针的培养液，用pbs冲洗掉残余培养液。然后用多聚甲醛溶液固定细胞，再次用pbs溶液冲洗，加入0.1%的tritonx-100，10分钟，以增加细胞膜通透性。再次用pbs溶液冲洗3次，加入2%bsa溶液封闭非特异性活性位点。然后加入早期核内体一抗溶液孵育，弃掉一抗，pbs冲洗，加入带有绿色荧光的二抗，常温避光孵育。再次pbs冲洗，最后加防荧光淬灭封片液。置于激光共聚焦显微镜观测。

实施例2

将带有荧光cy3的替换链dna1与其他序号的207条订书钉链等量地溶解到milliq水中，使每条链的最终浓度为200nm。将m13mp18单链dna（100nm）与混好的208条短链(200nm)以摩尔浓度比1:10的比例混合在1×tae-mg²⁺溶液中，其中m13mp18单链dna的最终浓度为5nm，短链最终浓度为50nm。将混好的溶液放入pcr仪中,设定反应程度95℃持续3分钟，然后缓慢降温至4℃，降温速率为0.2℃/10s，得到dna纳米成像探针。

将上述步骤中所制备的dna纳米成像探针加入细胞培养液中与细胞共孵育培养10小时。培养结束后，弃掉含有dna纳米成像探针的培养液，用pbs冲洗掉残余培养液。然后用多聚甲醛溶液固定细胞，再次用pbs溶液冲洗，加入0.1%的tritonx-100，10分钟，以增加细胞膜通透性。再次用pbs溶液冲洗3次，加入2%bsa溶液封闭非特异性活性位点。然后加入晚期核内体一抗溶液孵育，弃掉一抗，pbs冲洗，加入带有绿色荧光的二抗，常温避光孵育。再次pbs冲洗，最后加防荧光淬灭封片液。置于激光共聚焦显微镜观测。

实施例3

将带有荧光fitc的替换链dna1与其他序列号的207条订书钉链等量地溶解到milliq水中，使每条链的最终浓度为200nm。将m13mp18单链dna（100nm）与混好的208条短链(200nm)以摩尔浓度比1:7的比例混合在1×tae-mg²⁺溶液中，其中m13mp18单链dna的最终浓度为5nm，短链最终浓度为50nm。将混好的溶液放入pcr仪中,设定反应程度95℃持续3分钟，然后缓慢降温至4℃，降温速率为0.2℃/10s，得到dna纳米成像探针。

将上述步骤中所制备的dna纳米成像探针加入细胞培养液中与细胞共孵育培养2小时。培养结束后，弃掉含有dna纳米成像探针的培养液，用pbs冲洗掉残余培养液。然后用多聚甲醛溶液固定细胞，再次用pbs溶液冲洗，加入0.1%的tritonx-100，10分钟，以增加细胞膜通透性。再次用pbs溶液冲洗3次，加入2%bsa溶液封闭非特异性活性位点。然后加入溶酶体一抗溶液孵育，弃掉一抗，pbs冲洗，加入带有红色荧光的二抗，常温避光孵育。再次pbs冲洗，最后加防荧光淬灭封片液。置于激光共聚焦显微镜观测。

实施例4

将带有荧光fam的替换链dna1与其他序列号的207条订书钉链等量地溶解到milliq水中，使每条链的最终浓度为200nm。将m13mp18单链dna（100nm）与混好的208条短链(200nm)以摩尔浓度比1:9的比例混合在1×tae-mg²⁺溶液中，其中m13mp18单链dna的最终浓度为5nm，短链最终浓度为50nm。将混好的溶液放入pcr仪中,设定反应程度95℃持续3分钟，然后缓慢降温至4℃，降温速率为0.2℃/10s，得到dna纳米成像探针。

将上述步骤中所制备的dna纳米成像探针加入细胞培养液中与细胞共孵育培养24小时。培养结束后，弃掉含有dna纳米成像探针的培养液，用pbs冲洗掉残余培养液。然后用多聚甲醛溶液固定细胞，再次用pbs溶液冲洗，加入0.1%的tritonx-100，10分钟，以增加细胞膜通透性。再次用pbs溶液冲洗3次，加入2%bsa溶液封闭非特异性活性位点。然后加入高尔基体一抗溶液孵育，弃掉一抗，pbs冲洗，加入带有红色荧光的二抗，常温避光孵育。再次pbs冲洗，最后加防荧光淬灭封片液。置于激光共聚焦显微镜观测。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

<110>上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

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<210>83

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>

ttaatgccttatttcaacgcaagggcaaagaa

<210>84

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>

ttagcaaatagatttagttt]gaccagtacctt

<210>85

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<212>dna

<213>人工序列

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taattgctttaccctgactattatgaggcatagtaagagc

<210>86

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

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ataaagcctttgcgggagaagcctggagagggtag

<210>87

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>

taagaggtcaattctgcgaacgagattaagca

<210>88

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

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aacactatcataacccatcaaaaatcaggtctccttttga

<210>89

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atgaccctgtaatacttcagagca

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<212>dna

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taaagctatataacagttgattcccatttttg

<210>91

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

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cggatggcacgagaatgaccataatcgtttaccagacgac

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<211>35

<212>dna

<213>人工序列

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taattgcttggaagtttcattccaaatcggttgta

<210>93

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<212>dna

<213>人工序列

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gataaaaaccaaaatattaaacagttcagaaattagagct

<210>94

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

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actaaagtacggtgtcgaatataa

<210>95

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tgctgtagatccccctcaaatgctgcgagaggcttttgca

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<212>dna

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aaagaagttttgccagcataaatattcattgactcaacatgtt

<210>97

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

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aatactgcggaatcgtagggggtaatagtaaaatgtttagact

<210>98

<211>32

<212>dna

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<210>99

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caacagtttatgggattttgctaatcaaaagg

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<211>32

<212>dna

<213>人工序列

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gccgctttgctgaggcttgcaggggaaaaggt

<210>101

<211>32

<212>dna

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gcgcagactccatgttacttagcccgttttaa

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<211>32

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cctcagaaccgccacccaagcccaataggaacgtaaatga

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attttctgtcagcggagtgagaataccgatat

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attcggtctgcgggatcgtcacccgaaatccg

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<211>40

<212>dna

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<211>40

<212>dna

<213>人工序列

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agacgttaccatgtaccgtaacacccctcagaaccgccac

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<212>dna

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cacgcataagaaaggaacaactaagtctttcc

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<212>dna

<213>人工序列

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attgtgtctcagcagcgaaagacaccatcgcc

<210>110

<211>40

<212>dna

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ttaataaaacgaactaaccgaactgaccaactcctgataa

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<211>40

<212>dna

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<212>dna

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<211>32

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gacaacaagcatcggaacgagggtgagatttg

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tatcatcgttgaaagaggacagatggaagaaaaatctacg

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tagttgcgaattttttcacgttgatcatagtt

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<211>32

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<211>40

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<212>dna

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<210>120

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aacagcttgctttgaggactaaagcgattata

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<211>40

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tctttgattagtaatagtctgtccatcacgcaaattaaccgtt

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cgcgtcrgataggaacgccatcaacttttaca

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ctctagagcaagcttgcatgcctggtcagttg

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tttcaccagcctggccctgagagaaagccggcgaacgtgg

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<211>40

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gtaaccgtctttcatcaacattaaaatttttgttaaatca

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acgttgtattccggcaccgcttctggcgcatc

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cggcggattgaattcaggctgcgcaacgggggatg

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tcttcgctattggaagcataaagtgtatgcccgct

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ttccagtccttataaatcaaaagagaaccatcacccaaat

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gcgctcacaagcctggggtgccta

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cgatggcccacatcgtatagcccgagatagggattgcgtt

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aactcacattattgagtgttgttccagaaaccgtctatcaggg

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acgtggactccaacgtcaaagggcgaatttggaacaagagtcc

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ttaattaattttttaccatatcaaa

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ctgtccagacgtataccgaacga

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tcaagattagtgtagcaatact

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tttaattgtatttccaccagagcc

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actacgaaggcttagcaccatta

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ataaggcttgcaacaaagttac

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<211>25

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gtgggaacaaatttctatttttgag

<210>205

<211>24

<212>dna

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cggtgcgggccttccaaaaacatt

<210>206

<211>23

<212>dna

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atgagtgagcttttaaatatgca

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actattaaagaggatagcgtcc

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gcgcttaatgcgccgctacagggc