野生大豆XLOC_023202基因在提高大豆属植物胞囊线虫抗性中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及野生大豆xloc_023202基因在提高大豆属植物胞囊线虫抗性中的应用。

背景技术：

大豆胞囊线虫病是大豆生产上的重要病害。从大豆-大豆胞囊线虫互作角度，分析大豆抗性相关基因，进而解析大豆对胞囊线虫的抗性机制，筛选抗性相关基因对于大豆抗胞囊线虫育种具有重要价值。

目前，有关大豆胞囊线虫侵染下栽培大豆根系基因表达分析的报道较多，而且其中绝大多数报道是针对侵染早期，试图解析大豆胞囊线虫侵入根系以及合胞体形成过程中，大豆的基因表达情况。抗病种质的抗病机制是在合胞体周围发生坏死，进而限制大豆胞囊线虫发育，甚至导致线虫死亡。因此，上述报道中发现了许多有关植物防御、细胞合成、细胞降解、代谢过程相关的基因。

野生大豆是栽培大豆的祖先，具有比栽培大豆更为丰富的遗传变异。因此可能存在与栽培大豆不同的抗性机制。目前，尚未见关于大豆胞囊线虫侵染下野生大豆根系基因表达的报道。

研究表明，大豆对胞囊线虫的抗病机制有多种，而侵染早期，抗病种质在合胞体周围发生坏死只是其一。大豆对胞囊线虫的抗病性在整个大豆胞囊线虫侵染过程中都存在。因此，现有技术中所找到的大豆胞囊线虫抗性基因不够全面。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明研究了接种大豆胞囊线虫后9、15和20天时抗病和感病野生大豆的基因表达情况，鉴定出抗性相关基因，并对在2个以上取样时期都存在的基因进行了解析和验证，从而找到了抗病野生大豆中特异差异表达，并在接种后9和15天2个时期明显上调的基因xloc_023202。

本发明涉及野生大豆xloc_023202基因在提高大豆属植物胞囊线虫抗性中的应用；xloc_023202基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。该基因是栽培大豆glyma.14g003800的同源基因，预测编码的蛋白比glyma.14g003800编码的蛋白多6个氨基酸。

优选的，如上所述的应用，以所述xloc_023202基因作为分子标记，培育高胞囊线虫抗性的大豆属植物新品种。

优选的，如上所述的应用，将所述xloc_023202基因通过转基因方法转入大豆属植物以提高其胞囊线虫抗性。

优选的，如上所述的应用，所述转基因方法具体包括：

(1)构建含有所述xloc_023202基因的表达载体；

(2)将步骤(1)获得的表达载体直接导入大豆属植物细胞；或通过中间宿主细胞介导导入大豆属植物细胞；

(3)再生出转基因植物；和

(4)选择出转基因植物；并且

(5)任选地，增殖步骤(4)获得的植物以获得后代。

优选的，如上所述的应用，优选的中间宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、农杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌，最优选的为农杆菌。

农杆菌可包含质粒(例如ti或ri质粒等常规质粒)，所述质粒中载有所述xloc_023202的核苷酸序列，所述质粒在用农杆菌转染后被转移至植物，而质粒上载有的目的序列被整合进植物细胞的基因组中。本发明的核苷酸序列尤其适用于大豆的植物细胞，但不排除在其它物种(例如油菜、小麦、燕麦、马铃薯等)中也具有胞囊线虫抗性的作用。

优选的，如上所述的应用，所述直接导入大豆属植物细胞的方法包括：基因枪介导转化法、花粉管通道法或脂质体转化法。

所述xloc_023202的核苷酸序列可用于转化植物并获得转化的植物。在现有技术中广泛描述植物转化。众所周知，可采用多种系统例如质粒载体，脂质体，电穿孔，微量注射，扩散，基因枪，磷酸钙共沉淀，使用病毒载体等。在本发明中，其所有都组成本发明的部分。

优选的，如上所述的应用，在步骤(4)中，选择出转基因植物时，鉴定所转入的所述xloc_023202基因的表达水平，选择表达基因表达量高的植物。

优选的，如上所述的应用，所述选择表达基因表达量高的植物的方法为：

提取待检测转基因植物的总rna，使用seqidno:2和seqidno:3所示的上下游引物对xloc_023202进行qrt-pcr检测。

优选的，如上所述的应用，所述qrt-pcr在进行循环扩增时的退火温度均为55℃～65℃。

优选的，如上所述的应用，所述大豆属植物包括：大豆glycinemax(l.)merr.、短绒野大豆glycinetomentellahayata、野生大豆glycinesojasieb.etzucc.、澎湖大豆glycineclandestinawendl.、宽叶蔓豆glycinegracilisskv.、烟豆glycinetabacinabenth.、扁豆荚大豆glycinedolichocarpatateishi&ohashi以及阔叶大豆glycinetomentellahayata中第一种或多种。

与现有技术相比，本发明所提供的大豆属植物胞囊线虫抗性基因在接种胞囊线虫后9天和15天时明显上调，这提示该基因在提高大豆属植物胞囊线虫抗性方面具有非常好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示大豆胞囊线虫成功侵染了供试野生大豆的根系；接种后9天，2龄幼虫已经侵入根系(图1a，e)，接种后15天，已有部分2龄幼虫发育成3龄幼虫(图1b，f)，接种后20天，根系中同时存在2龄、3龄和4龄大豆胞囊线虫(图1c，d，g，h)；

图2为10个差异表达基因的rna-seq表达量(log2(fc))和qrt-pcr表达量(log2(fc))d9：接种后9天,d15：接种后15天；d20：接种后20天。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

一、材料与方法

1、大豆胞囊线虫卵溶液的制备

含有大豆胞囊线虫的根际土壤取自吉林省洮南市吉林省农业科学院洮南综合试验站大豆田。其大豆胞囊线虫hg类型为hg0。病土中的大豆胞囊线虫在大豆品种绥农14上进行扩繁。将绥农14的种子种植在病土中，35天后将根从土中拔出，置于层筛上(自上而下分别为20、40和60目网筛)，用较大压力的水流冲洗掉根系上的胞囊，将其收集在60目筛网上。将60目筛网上的胞囊收集到1l的烧杯中，并利用胞囊、根系碎片、土壤等物质的沉降速度不同，将胞囊溶液进一步纯化。将纯化后的胞囊溶液倒入60目网筛上，用橡胶棒将其碾碎在筛网上，使之释放出卵和2龄幼虫，用洗瓶冲洗，将卵和2龄幼虫冲入2层套筛上(自上而下依次为200目和500目)，用自来水多次冲洗200目网筛，将卵收集在500目网筛上。将500目网筛上的卵转移到50ml烧杯中，配制成23000个卵·ml-1的卵悬浮液，备接种用。

2、抗病和感病野生大豆种质

野生大豆种质zyd03685高抗大豆胞囊线虫hg0种群，其胞囊指数为1.4，zyd02688高感大豆胞囊线虫hg0种群，其胞囊指数为101.6

3、接种处理方法

供试野生大豆种子60粒用0.5％naclo溶液消毒3min后，用流动自来水冲洗4次。将消过毒的种子刻皮后种植在盛有高温灭菌珍珠岩的塑料钵中。在27℃，9h光照/15h黑暗的条件下培养7d后，第一片三出复叶展开。将苗小心地拔出，并冲洗干净。将长势一致的植株分为6组，每组5个植株，3组为接种虫卵处理，3组为对照处理(接种液为自来水)。将每组植株移到盛有高温灭菌珍珠岩的塑料钵中(珍珠岩占塑料钵容积的2％)，在根表面接种5ml新鲜的虫卵悬浮液(23000个卵·ml-1)(接种虫卵组)或5ml的自来水(对照组)，然后覆2cm厚的高温灭菌的珍珠岩。放置于27℃，9h光照/15h黑暗的条件下培养。

接种后9d，每随机选取1个对照组和1个处理组，将每个塑料钵的植株轻轻拔出，并将根系冲洗干净。从5个植株的根系中随机取3个植株的根系快速放置于液氮中，剩余2株用于大豆胞囊线虫侵染状况的观察。剩余4组的植株分别轻轻拔出，将根表面的虫卵和线虫冲洗掉后重新移栽到盛有高温灭菌珍珠岩的塑料钵中，放置在27℃，9h光照/15h黑暗的条件下继续培养。分别在接种后15d和20d，随机选取1个对照组和1个处理组，将每个塑料钵的植株轻轻拔出，并将根系冲洗干净。从5个植株的根系中随机取3个植株的根系快速放置于液氮中，剩余2株用于大豆胞囊线虫侵染状况的观察。

4、rna的提取和测序

将液氮中保存的根系样品，在液氮中研磨成粉末后，利用trizol试剂((invitrogen,上海)根据其说明书进行总rna的提取，用agilent2100分析仪和nanodrop分光光度计进行rna浓度和质量测定。文库的构建及测序(illuminahiseq^tm2000)由bgi(深圳)完成。

用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，用nanodrop2000检测rna的浓度和纯度。使用takaraprimescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser进行cdna合成，反转录体系为40μl，其中含有14μlrna溶液。

5、数据处理

利用fastqcandfastxtoolkits对原始测序序列进行接头及低质量序列(质量值q≤30de碱基数占10％以上)的删除处理。以野生大豆基因组(genbank/embl/ddbj数据库，登记号为aznc00000000.1)为参照基因组，利用tophat2(v2.0.8)进行序列的拼接。(qietal.2014).其参数设置为：允许1个碱基的错配，30-100,000内含子的长度(linetal.2014)。以栽培大豆基因组(g.maxwm82a2.v1.，下载自phytozome10)为参照基因组，利用cufflinksv.2.2.1进行基因比对和基因注释。(trapnelletal.2012).利用htseqv.0.6.1进行基因表达量统计分析(andersetal.2015)，利用edgerv.3.2.3差异表达分析(robinsonetal.2010；andersetal.2013).选用28个看家基因的同源序列进行广义线性模型的偏差估计，接种处理vs对照的差异显著性临界值为fdr＝0.05。

6、go分析

利用agrigo网页的(bioinfo.cau.edu.cn)geneontologyanalysis程序进行go注释(duetal.2010；zhouetal.2010)，参照基因组为g.maxwm82a2.v1model.fishertest采用yekutielicorrectedp，显著性水平设为α＝0.05。

7、qrt-pcr

供试根系样品与rna-seq实验的相同。将液氮中保存的根系样品，在液氮中研磨成粉末后，采用takaraminibestplantrnaextractionkit根据其说明书进行rna的提取，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，用nanodrop2000检测rna的浓度和纯度。使用takaraprimescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser进行cdna合成，反转录体系为40μl，其中含有14μlrna溶液。

以cons6/skip16(glyma12g05510)为对照，进行了10个基因表达量的qrt-pcr验证。利用oligo6.0软件设计了qrt-pcr引物序列(表1)，由华大基因(北京)合成。qrt-pcr在基因有限公司ecotm荧光定量pcr仪上进行，操作参照takarasybrpremixextaqtmⅱ(tlirnaasehplus)的试剂盒说明书进行。20μlqrt-pcr反应体系包含10μl的sybrpremixextaqtm溶液，8μl的cdna溶液，0.38μm的上游引物和0.38μm的下游引物。反应程序为：50℃2min；95℃30s；(95℃5s，60℃30s)×40个循环；95℃15s；55℃15s；95℃15s。每个样品设置2个重复。

表1引物序列

8、dna提取及基因序列测定

取抗病种质zyd03685的35天龄幼苗叶片，于液氮中研磨成粉末。根据dna提取试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)所附的说明书提取叶片基因组dna(ctab法)。利用引物seqidno:16和seqidno:17进行xloc_023202的pcr扩增，采用pcr产物直接测序方法获得xloc_023202序列。

二、结果

1、大豆胞囊线虫的侵染检测

图1显示大豆胞囊线虫成功侵染了供试抗、感野生大豆的根系。接种后9天，2龄幼虫已经侵入根系(图1a，e)，接种后15天，已有部分2龄幼虫发育成3龄幼虫(图1b，f)，接种后20天，根系中同时存在2龄、3龄和4龄大豆胞囊线虫(图1c，d，g，h)。

2、差异表达基因

rna-seq获得了共计81466062个原始reads，平均每个文库获得6788839个原始reads。经过去杂后共获得73152136个cleanreads，平均每个文库6096011个cleanreads。文库中有58.4％-91.3％的cleanreads能比对到野生大豆基因组上。在接种后9,15,and20天3个取样时期，抗病野生大豆中分别发现619，65和8个差异表达基因；感病野生大豆中分别发现327，460和115个差异表达基因。

表2rna-seq文库的参数

^ad9：接种后9天；d15：接种后15天；d20：接种后20天；c：对照处理(接种水)；t：接种大豆胞囊线虫虫卵；r：抗病野生大豆；s：感病野生大豆。

3、抗病野生大豆中，在2个以上取样时期发现的差异表达基因

比较分析只存在抗病野生大豆中的差异表达基因，发现共有24个差异表达基因在2个以上取样时期都存在，其中18个被前人发现与大豆抗菌核病、sds、锈病、大豆胞囊线虫病以及大豆防御有关，其余6个尚未见与抗病相关的报道。

4、qrt-pcr验证

针对上述6个尚未见与抗病相关报道的差异表达基因，进行了其表达的qrt-pcr验证。研究发现，rna-seq的基因表达量与qrt-pcr基因表达量呈极显著相关(p＝0.01)，相关系数为0.69。差异表达基因xloc_023202的rna-seq的基因表达量与qrt-pcr基因表达量相关性非常高，达0.992，并且在接种后9天和15天时表达量比对照相比明显上调。xloc_023202是栽培大豆glyma.14g003800(未知基因)的同源基因，在接种后9天和15天时，与不接种相比，它的表达量增加了5倍以上。

5、xloc_023202基因序列

采用pcr产物直接测序方法获得抗病野生大豆种质zyd03685的xloc_023202基因序列。xloc_023202基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。是栽培大豆glyma.14g003800的同源基因，但预测编码的蛋白比glyma.14g003800编码的蛋白多6个氨基酸。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>吉林省农业科学院

<120>野生大豆xloc_023202基因在提高大豆属植物胞囊线虫抗性中的应用

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